Mikrokirurgisk obstruktion av testikel fusion i Spodoptera litura
Summary
Aluminiumfolie sattes mikrokirurgiskt in mellan testikelerna i Spodoptera litura för att hindra fusionen av testikel. Förfarandet omfattar frysning, fixering, desinfektion, snitt, placering av barriär, suturering, postoperativ utfodring och inspektion. Detta tillvägagångssätt ger en metod för att störa vävnadsbildning.
Abstract
Istället för att använda genetiska metoder som RNA-interferens (RNAi) och grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska repetitioner (CRISPR)/CRISPR-associerade endonuclease Cas9, sattes en fysisk barriär mikrokirurgiskt in mellan testikel av Spodoptera litura för att studera effekten av denna mikrokirurgi på dess tillväxt och reproduktion. Efter att ha infogat aluminiumfolie mellan testikerna fortsatte insektssmältning under metamorfos normalt. Insektstillväxt och utveckling ändrades inte anmärkningsvärt; Antalet spermiebuntar ändrades dock om testiklar fusion stoppades av mikrokirurgin. Dessa resultat innebär att blockera testikel fusion kan påverka manliga reproduktionsförmåga. Metoden kan tillämpas ytterligare för att avbryta kommunikationen mellan organ för att studera funktionen hos specifika signalvägar. Jämfört med konventionell kirurgi kräver mikrokirurgi endast frysning av bedövning, vilket är att föredra framför koldioxidestetisering. Mikrokirurgi minimerar också området för operationsplatsen och underlättar sårläkning. Valet av material med specifika funktioner behöver dock undersökas ytterligare. Att undvika vävnadsskada är avgörande när man gör snitt under operationen.
Introduction
Fusion är ett vanligt fenomen i vävnads- eller organutveckling. Exempel inkluderar dorsala stängning och bröstkorg stängning i Drosophila1 och gommen morfogenes, neurala röret morfogenes och hjärtat morfogenes hos möss och kyckling2. CRISPR och RNAi har tillämpats för att undersöka genernas roller i fusionsprocessen2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) är ett skadligt polyfag skadedjur som är utbredd i tropiska och subtropiska områden i Asien, inklusive Kina4,5,6. Den breda fördelningen av S. litura tillskrivs delvis dess kraftfulla reproduktiva förmåga, vilket är relevant för gonadutveckling. Manlig infertilitet är ett tillvägagångssätt för att bekämpa detta skadedjur. Som visas i den schematiska figuren testikelstruktur omges testiklarna av testikelslidan, inklusive den yttre manteln (peritonealslida) och inre basal lamina. Den basala laminan sträcker sig invändigt för att bilda follikulärt epitel och separerar testikelns inre område i fyra kammare som heter folliklar (figur 1).
I folliklarna utvecklas spermatogonia till spermatozoa efter mitos och meios, och sedan justerar spermatozoerna i spermasäckarna i samma riktning för att bilda spermier7. Under spermatogenes skiljer sig de primära spermatocyterna i eupyrenspermatrar eller apyrenspermas. Spermatocyter i larvfasen utvecklas till eupyrensperma med en lång svans ansluten till ett huvud av en långsträckt kärna; dessa kan befrukta ägg. Omvänt utvecklas spermatocyter i mitten av pupalfasen till apyrensperma med en kasserad kärna; dessa spermier hjälper överlevnad, rörelse och befruktning av eupyren sperm9,10. Den 6: e dagen av poppan är den period under vilken testikarna har rikliga eupyrene och apyrene spermiebuntar.
Bild 1: Schematiskt diagram över testikelstrukturen hos Lepidoptera insekter11. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Testikelfusion förekommer i de flesta insekter i Lepidoptera-ordningen11,12, särskilt hos de arter som är jordbruksskadedjur. Testikelfusion avser ett par testiklar som växer bilateralt i larvfasen, närmar sig och följer varandra och så småningom integreras i en enda gonad11. I Spodoptera litura händer det under metamorfos från larven till pupalstadiet. Från dag 1 av den 5: e instar (L5D1) till dag 4 av den 6: e instar (L6D4) växer testikeparet gradvis i storlek och färgen blir ljusgul från elfenbensvit. Det blir svagt rött när det når prepupalfasen (L6D5 till L6D6). Två bilaterala symmetriska testiklar närmar sig varandra under prepupalstadiet, smälter till en och vrider motsols (doral view) för att producera en enda testikel i pupal- och vuxenfaserna11. Detta fenomen förekommer inte i silkesmaskar, som har betydande ekonomisk betydelse och har tämjts i 5000 år13. Det antas således att testikeernas fusion förbättrar reproduktionsförmågan.
För att bestämma betydelsen av Spodoptera litura testikelfusion är det viktigt att undersöka effekterna av att blockera processen. I detta protokoll sattes aluminiumfolie mikrokirurgiskt in mellan testikarna för att hålla dem åtskilda, och de därav följande förändringarna i utvecklingen av insekterna och deras testi testierna studerades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter mikrokirurgiskt hindrande testifest fusion i Spodoptera litura minskade antalet spermier buntar, vilket stödde hypotesen att denna fusion är fördelaktig för reproduktionsförmågan. Kirurgisk manipulation har använts för att studera den fysiologiska utvecklingen av insekter sedan början av 1900-talet. För att avgöra om hjärnnerven regleras av insektsmetamorfos utförde vissa forskare procedurer som ligatur och halshuggning på olika insekter (inklusive Rhodnius prolixus of Hem…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Nos.:31772519, 31720103916; ) och ett öppet bidrag från State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (Nr.: sklsgb2013003).
Materials
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. . Physiological systems in insects. , (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and ‘metamorphosis’ in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
