Analyse af lymfeknudevolumen ved ultrahøjfrekvent ultralydsbilleddannelse i Braf / Pten genetisk manipuleret musemodel af melanom
Summary
Melanom er en meget aggressiv sygdom, der hurtigt spredes til andre organer. Denne protokol beskriver anvendelsen af ultrahøjfrekvent ultralydsbilleddannelse kombineret med 3D-gengivelse for at overvåge volumenet af de indinale lymfeknuder i Braf / Pten-musemodellen af metastatisk melanom.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisk manipulerede mus (Braf/Pten mus) anvendes i vid udstrækning som en in vivo-model af metastatisk melanom. Når en primær tumor er blevet induceret ved tamoxifenbehandling, observeres en stigning i metastatisk byrde inden for 4-6 uger efter induktion. Dette papir viser, hvordan Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) billeddannelse kan udnyttes til at overvåge stigningen i metastatisk involvering af de indinale lymfeknuder ved at måle stigningen i deres volumen.
UHFUS-systemet bruges til at scanne anæstesierede mus med en UHFUS lineær sonde (22-55 MHz, aksial opløsning 40 μm). B-mode billeder fra de indinale lymfeknuder (både venstre og højre side) erhverves i en kortakse visning, der placerer dyrene i dorsal liggende. Ultralydsoptegnelser erhverves ved hjælp af en 44 μm trinstørrelse på en motoriseret mekanisk arm. Derefter importeres todimensionelle (2D) B-mode erhvervelser til softwareplatformen til ultralydsbilledefterbehandling, og inguinale lymfeknuder identificeres og segmenteres halvautomatisk i de erhvervede tværsnitsbilleder 2D. Endelig opnås en total rekonstruktion af det tredimensionelle (3D) volumen automatisk sammen med gengivelsen af lymfeknudevolumenet, som også udtrykkes som en absolut måling.
Denne ikke-invasive in vivo-teknik tolereres meget godt og tillader planlægning af flere billeddannelsessessioner på det samme forsøgsdyr over 2 uger. Det er derfor ideelt at vurdere virkningen af farmakologisk behandling på metastatisk sygdom.
Introduction
Melanom er en aggressiv form for hudkræft, der ofte spredes til andre hudsteder (subkutane metastaser) samt til lymfeknuder, lunger, lever, hjerne og knogler1. I det sidste årti er nye lægemidler blevet introduceret i klinisk praksis og har bidraget til at forbedre den forventede levetid for metastatiske melanompatienter. Der er dog fortsat begrænsninger, herunder variabel responstid og -grad, alvorlige bivirkninger og genopblussen af erhvervet resistens1. Derfor er det afgørende at opdage metastatisk spredning i sine tidlige stadier, dvs. når det kommer til de lokale lymfeknuder.
En biopsi af de lokale lymfeknuder (sentinel lymfeknuder) udføres normalt for at kontrollere tilstedeværelsen af melanomceller. Ultralydsbilleddannelse tager imidlertid fat som en ikke-invasiv metode til påvisning af metastatisk involvering, da den overgår klinisk evaluering og kan hjælpe med at undgå en unødvendig biopsi2,3,4. Desuden synes ultralydsbilleddannelse passende til lymfeknudeovervågning, især i tilfælde af fremskreden alder og / eller comorbiditeter5,6. De funktioner, der detekteres ved ultralydsanalyse og tillader differentiering mellem normale og metastatiske lymfeknuder, omfatter øget størrelse (volumen), ændring af form fra oval til rund, uregelmæssig margen, ændret ekkogent mønster og ændret (øget) vaskularisering7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisk manipulerede mus (Braf/Pten-mus) er for nylig blevet stillet til rådighed for det videnskabelige samfund som en vævsspecifik og inducerbar model for metastatisk melanom8. I denne dyremodel udvikler primære tumorer sig meget hurtigt: de bliver synlige inden for 2-3 uger efter induktionen af skiftet fra vildtype (wt) Braf til BrafV600E og af tabet af Pten, mens de når et volumen på 50-100 mm3 inden for 4 uger. I de følgende 2 uger ledsages væksten af den primære tumor af en progressiv stigning i metastatisk byrde på andre hudsteder, lymfeknuder og lunger.
Braf/Pten-mus er blevet anvendt i vid udstrækning til flere formål, herunder dissektion af signalveje involveret i melanomagenese9,10, identifikation af melanomceller af oprindelse11,12,13 og test af nye terapeutiske muligheder med hensyn til både målrettet terapi og immunterapi8,14,15,16 . Specifikt brugte vi Braf/Pten-mus til at demonstrere, at svækkede Listeria monocytogenes (Lmat) virker som en anti-melanomvaccine. Når Lmat administreres systemisk i den terapeutiske indstilling, er Lmat ikke forbundet med den samlede toksicitet, da den selektivt akkumuleres på tumorsteder. Desuden forårsager det et bemærkelsesværdigt fald i primær melanommasse og en reduktion i metastatisk byrde i lymfeknuder og lunger. På molekylært niveau forårsager Lmat apoptotisk drab på melanomceller, hvilket i det mindste delvist skyldes ikke-celleautonome aktiviteter (rekruttering på stedet af CD4 + og CD8 + T-lymfocytter)16.
Når Braf/Pten-mus anvendes til melanommodellering, kan væksten af primære tumorer og subkutane metastaser overvåges ved hjælp af tykkelsesmålinger. Inddragelsen af lymfeknuder og lunger skal dog undersøges ved hjælp af en alternativ teknik, muligvis en ikke-invasiv, der gør det muligt for forskere at følge det samme dyr over tid. Dette papir beskriver brugen af ultralydsbilleddannelse (figur 1) kombineret med en efterfølgende 3D-volumetrisk analyse af de opnåede data til langsgående overvågning af stigningen i størrelse (volumen) af inguinale lymfeknuder.
Protocol
Representative Results
Discussion
De data, der er opnået i denne undersøgelse, attesterer ultralydsbilleddannelsens evne til at overvåge den metastatiske involvering af indinale lymfeknuder i Braf / Pten-musemodellen for metastatisk melanom. Som vist tidligere16 er denne teknik især nyttig til at vurdere effekten af lægemiddelbehandling. Dette skyldes, at det gør det muligt at overvåge ændringen i lymfeknudevolumen i det samme dyr over tid ved at sammenligne de målinger, der indsamles ved t1 andt2<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke S. Burchielli (FTGM, Pisa) for hendes hjælp med dyreforsøg. Dette arbejde blev støttet af ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutionel finansiering til LP; MFAG #17095 tildelt af AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro til LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma – Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
