Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação
Summary
O decote sob metas e tagmentação (CUT&Tag) é uma estratégia eficiente de perfil epigenômico de cromatina eficiente. Este protocolo apresenta uma estratégia refinada da CUT&Tag para o perfil das modificações de histonas nas plantas.
Abstract
Regulação epigenômica no nível cromático, incluindo modificações de DNA e histona, comportamentos de fatores de transcrição e RNAs não codificantes com suas proteínas recrutadas, levam ao controle temporal e espacial da expressão genética. O decote sob alvos e tagmentação (CUT&Tag) é um método de enzimática em que a proteína específica da cromatina é primeiro reconhecida por seu anticorpo específico, e então o anticorpo amarra uma proteína de fusão A-transposase (pA-Tn5), que corta a cromatina alvo in situ pela ativação de íons de magnésio. Aqui, fornecemos nosso protocolo CUT&Tag publicado anteriormente usando núcleos intactos isolados de folhas de algodão allortetraploid com modificação. Este protocolo passo a passo pode ser usado para pesquisa epigenômica em plantas. Além disso, modificações substanciais para o isolamento dos núcleos vegetais são fornecidas com comentários críticos.
Introduction
Os locais de DNA de ligação do fator de transcrição e a cromatina aberta associadas às marcas de modificação de histona servem papéis funcionais críticos na regulação da expressão genética e são os principais focos da pesquisa epigenética1. Convencionalmente, o ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) juntamente com sequenciamento profundo (ChIP-seq) tem sido usado para a identificação em todo o genoma de modificação de histona cromatina específica ou alvos de DNA com proteínas específicas, e é amplamente adotado no campo da epigenética2. O decote sob alvos e a tecnologia de tagmentação (CUT&Tag) foi originalmente desenvolvido pelo Laboratório Henikoff para capturar os fragmentos de DNA afiliados à proteína em todo o genoma5. Quando comparado ao ChIP, a CUT&Tagcan gera bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado3. Até o momento, foram estabelecidos métodos para análise de regiões de cromatina com modificações específicas de histona utilizando CUT&Tag em células animais4,5. Especificamente, cut&tag de célula única (scCUT&Tag) também foi desenvolvido com sucesso para tecidos humanos e células6. No entanto, devido à complexidade da parede celular e metabólitos secundários, a CUT&Tag ainda é tecnicamente desafiadora para tecidos vegetais.
Anteriormente, relatamos um protocolo CUT&Tag usando núcleos intactos isolados de folhas de algodão allotetraploid4. Para demonstrar a eficiência do isolamento dos núcleos e da captura de DNA utilizando tecido vegetal, o procedimento de criação de perfil é apresentado aqui. Os principais passos incluem isolamento de núcleos intactos, incubação in situ com o anticorpo para modificação de cromatina, incubação transposase, integração adaptadora e preparação da biblioteca de DNA. A solução de problemas se concentra na preparação da biblioteca CUT&Tag para o isolamento dos núcleos da planta e controle de qualidade.
Neste estudo, apresentamos uma estratégia refinada da CUT&Tag para plantas. Não só fornecemos um protocolo passo-a-passo para o perfil H3K4me3 em folhas de algodão, mas também fornecemos uma metodologia otimizada para o isolamento dos núcleos vegetais, incluindo a estratégia de seleção da concentração de detergente para a lise celular adequada e a estratégia de filtragem dos núcleos. Passos detalhados com comentários críticos também estão incluídos neste protocolo atualizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos a CUT&Tag, uma tecnologia para gerar bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado em comparação com a imunoprecipitação de cromatina (ChIP). Nosso sucesso com o perfil H3K4me3 em folhas de algodão sugere que a CUT&Tag, que foi projetada pela primeira vez para células animais, também pode ser usada para células vegetais. Tanto o sistema tampão Tris comumente usado para o ensaio ChIP8…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado financeiramente em parte por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430), e fundos de pesquisa fundamental para as Universidades Centrais, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) e projeto JCIC-MCP.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
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