在靶标和标记下使用裂解分析植物中的H3K4me3修饰
Summary
靶标下裂解（CUT&Tag）是一种有效的染色质表观基因组分析策略。该协议提出了一种改进的CUT&Tag策略，用于分析植物中的组蛋白修饰。
Abstract
染色水平上的表观基因组调控，包括DNA和组蛋白修饰，转录因子的行为以及非编码RNA及其招募的蛋白质，导致基因表达的时间和空间控制。靶标下裂解（CUT&Tag）是一种酶系留方法，其中特异性染色质蛋白首先通过其特异性抗体识别，然后抗体系留蛋白A-转座酶（pA-Tn5）融合蛋白，该蛋白通过镁离子的活化 原位 裂解靶染色质。在这里，我们提供我们之前发表的CUT&Tag方案，使用从异体四倍体棉叶中分离出的完整细胞核进行修饰。这种循序渐进的方案可用于植物的表观基因组学研究。此外，还对植物核分离进行了实质性修改，并提出了批评性意见。
Introduction
转录因子结合DNA位点和与组蛋白修饰标记相关的开放染色质在调节基因表达方面起着关键的功能作用，是表观遗传学研究的主要焦点1。传统上，染色质免疫沉淀测定（ChIP）与深度测序（ChIP-seq）相结合已被用于全基因组鉴定特定染色质组蛋白修饰或具有特定蛋白质的DNA靶标，并在表观遗传学领域被广泛采用2。靶标下的切割和标记（CUT&Tag）技术最初由Henikoff实验室开发，用于捕获整个基因组中与蛋白质相关的DNA片段5。与 ChIP 相比，CUT&Tagcan 使用少量细胞和简化的程序以高分辨率和极低背景生成 DNA 文库3。迄今为止，已经建立了使用CUT&Tag分析具有特定组蛋白修饰的染色质区域的方法在动物细胞中4，5。具体而言，单细胞CUT&Tag（scCUT&Tag）也已成功开发用于人体组织和细胞6。然而，由于细胞壁和次级代谢物的复杂性，CUT&Tag对植物组织来说在技术上仍然具有挑战性。
此前，我们报道了一种 CUT&Tag 方案，该方案使用从同种异体四倍体棉叶中分离出的完整核4。为了证明使用植物组织进行细胞核分离和DNA捕获的效率，本文介绍了分析程序。主要步骤包括完整细胞核分离、与抗体 原位 孵育染色质修饰、转座酶孵育、适配器整合和 DNA 文库制备。故障排除的重点是用于植物核分离和质量控制的CUT&Tag库准备。
在这项研究中，我们提出了一个针对植物的改进的CUT&Tag策略。我们不仅为棉花叶片中的H3K4me3分析提供了分步方案，而且还为植物细胞核分离提供了优化的方法，包括选择洗涤剂浓度以进行适当细胞裂解的策略和过滤细胞核的策略。此更新的协议中还包含带有关键注释的详细步骤。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了CUT&Tag，这是一种以高分辨率和极低背景生成DNA文库的技术，与染色质免疫沉淀（ChIP）相比，使用少量细胞，程序简化。我们在棉花叶片中成功分析H3K4me3表明，CUT&Tag最初是为动物细胞设计的，也可以用于植物细胞。通常用于ChIP测定8 的Tris缓冲系统和用于动物CUT&Tag的HEPES缓冲系统都适用于使用植物核的CUT&Tag4，9。完…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金（NSFC，31900395，31971985，31901430）和中央大学基础研究基金海南崖州湾种子实验室（JBGS，B21HJ0403），中国海南省自然科学基金（320LH002）和JCIC-MCP项目的资助。
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
