Profilering af H3K4me3-modifikation i planter ved hjælp af spaltning under mål og tagmentering
Summary
Spaltning under mål og tagmentation (CUT&Tag) er en effektiv kromatin epigenomisk profileringsstrategi. Denne protokol præsenterer en raffineret CUT&Tag-strategi til profilering af histonmodifikationer i planter.
Abstract
Epigenomisk regulering på kromatisk niveau, herunder DNA- og histonmodifikationer, transkriptionsfaktorers adfærd og ikke-kodende RNA’er med deres rekrutterede proteiner, fører til tidsmæssig og rumlig kontrol af genekspression. Spaltning under mål og tagmentation (CUT &Tag) er en enzym-tethering metode, hvor det specifikke kromatinprotein først genkendes af dets specifikke antistof, og derefter binder antistoffet et protein A-transposase (pA-Tn5) fusionsprotein, som spalter det målrettede kromatin in situ ved aktivering af magnesiumioner. Her leverer vi vores tidligere offentliggjorte CUT & Tag-protokol ved hjælp af intakte kerner isoleret fra allortetraploide bomuldsblade med modifikation. Denne trinvise protokol kan bruges til epigenomisk forskning i planter. Derudover er væsentlige ændringer for isolering af plantekerner forsynet med kritiske kommentarer.
Introduction
Transkriptionsfaktorbindende DNA-steder og åbent kromatin forbundet med histonmodifikationsmærker tjener kritiske funktionelle roller i reguleringen af genekspression og er de vigtigste fokusområder for epigenetisk forskning1. Konventionelt er kromatinimmunfældningsassay (ChIP) kombineret med dyb sekventering (ChIP-seq) blevet anvendt til genom-dækkende identifikation af specifik kromatinhistonemodifikation eller DNA-mål med specifikke proteiner og er bredt vedtaget inden for epigenetik2. Spaltning under mål og tagmentationsteknologi (CUT&Tag) blev oprindeligt udviklet af Henikoff Lab til at fange de proteintilknyttede DNA-fragmenter i hele genomet5. Sammenlignet med ChIP genererer CUT&Tagcan DNA-biblioteker med høj opløsning og usædvanlig lav baggrund ved hjælp af et lille antal celler med en forenklet procedure3. Hidtil er der etableret metoder til analyse af kromatinregioner med specifikke histonmodifikationer ved hjælp af CUT&Tag i dyreceller4,5. Specifikt er enkeltcellet CUT&Tag (scCUT&Tag) også blevet udviklet med succes til humane væv og celler6. På grund af kompleksiteten af cellevæggen og sekundære metabolitter er CUT&Tag dog stadig teknisk udfordrende for plantevæv.
Tidligere rapporterede vi en CUT&Tag-protokol ved hjælp af intakte kerner isoleret fra allotetraploide bomuldsblade4. For at demonstrere effektiviteten af kerneisolering og DNA-fangst ved hjælp af plantevæv præsenteres profileringsproceduren her. De vigtigste trin omfatter intakt kerneisolering, in situ-inkubation med antistoffet til kromatinmodifikation, transposaseinkubation, adaptorintegration og DNA-biblioteksforberedelse. Fejlfindingen fokuserer på CUT&Tag-bibliotekets forberedelse til isolering af plantekerner og kvalitetskontrol.
I denne undersøgelse præsenterer vi en raffineret CUT&Tag-strategi for planter. Ikke alene leverer vi en trinvis protokol til H3K4me3-profilering i bomuldsblade, men vi leverer også en optimeret metode til isolering af plantekerner, herunder strategien for valg af koncentration af vaskemiddel til korrekt cellelyse og strategien til at filtrere kernerne. Detaljerede trin med kritiske kommentarer er også inkluderet i denne opdaterede protokol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi beskrevet CUT&Tag, en teknologi til generering af DNA-biblioteker i høj opløsning og usædvanlig lav baggrund ved hjælp af et lille antal celler med en forenklet procedure sammenlignet med kromatinimmunfældning (ChIP). Vores succes med H3K4me3 profilering i bomuldsblade tyder på, at CUT&Tag, som først blev designet til dyreceller, også kan bruges til planteceller. Både Tris-buffersystemet, der almindeligvis anvendes til ChIP-assay8, og HEPES-buffersystemet, der anvendes til dyre-CUT&Tag-arbejde<sup cla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet økonomisk af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) og Fundamental Research Funds for the Central Universities, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) og JCIC-MCP-projektet.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
