Profilering van H3K4me3 Modificatie in Planten met behulp van Splitsing onder Doelen en Tagmentatie
Summary
Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&Tag) is een efficiënte chromatine epigenomische profileringsstrategie. Dit protocol presenteert een verfijnde CUT&Tag strategie voor de profilering van histonmodificaties in planten.
Abstract
Epigenomische regulatie op chromatisch niveau, inclusief DNA- en histonmodificaties, gedrag van transcriptiefactoren en niet-coderende RNA’s met hun gerekruteerde eiwitten, leiden tot temporele en ruimtelijke controle van genexpressie. Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT & Tag) is een enzym-tetheringmethode waarbij het specifieke chromatine-eiwit eerst wordt herkend aan zijn specifieke antilichaam en vervolgens het antilichaam een eiwit A-transposase (pA-Tn5) fusie-eiwit bindt, dat het beoogde chromatine in situ splitst door de activering van magnesiumionen. Hier bieden we ons eerder gepubliceerde CUT & Tag-protocol met intacte kernen geïsoleerd uit allortetraploïde katoenbladeren met modificatie. Dit stapsgewijze protocol kan worden gebruikt voor epigenomisch onderzoek in planten. Daarnaast worden substantiële wijzigingen voor de isolatie van plantenkernen voorzien van kritische opmerkingen.
Introduction
Transcriptiefactorbindende DNA-sites en open chromatine geassocieerd met histonmodificatiemerken vervullen een cruciale functionele rol bij het reguleren van genexpressie en zijn de belangrijkste aandachtspunten van epigenetisch onderzoek1. Conventioneel is chromatine immunoprecipitatie assay (ChIP) in combinatie met diepe sequencing (ChIP-seq) gebruikt voor de genoombrede identificatie van specifieke chromatine histonmodificatie of DNA-doelen met specifieke eiwitten, en wordt op grote schaal toegepast op het gebied van epigenetica2. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) technologie werd oorspronkelijk ontwikkeld door het Henikoff Lab om de eiwit-geaffilieerde DNA-fragmenten in het hele genoom te vangen5. In vergelijking met ChIP genereert CUT&Tagcan DNA-bibliotheken met een hoge resolutie en een uitzonderlijk lage achtergrond met behulp van een klein aantal cellen met een vereenvoudigde procedure3. Tot op heden zijn methoden voor de analyse van chromatinegebieden met specifieke histonmodificaties met behulp van CUT&Tag vastgesteld in dierlijke cellen4,5. Specifiek is eencellige CUT&Tag (scCUT&Tag) ook met succes ontwikkeld voor menselijke weefsels en cellen6. Vanwege de complexiteit van de celwand en secundaire metabolieten is CUT&Tag echter nog steeds technisch uitdagend voor plantenweefsels.
Eerder rapporteerden we een CUT& Tag-protocol met intacte kernen geïsoleerd uit allotetraploïde katoenbladeren4. Om de efficiëntie van kernisolatie en DNA-vastlegging met behulp van plantenweefsel aan te tonen, wordt hier de profileringsprocedure gepresenteerd. De belangrijkste stappen omvatten intacte kernisolatie, in situ incubatie met het antilichaam voor chromatinemodificatie, transposase-incubatie, adaptorintegratie en DNA-bibliotheekvoorbereiding. De probleemoplossing richt zich op de CUT&Tag-bibliotheekvoorbereiding voor de isolatie van de kernen van de plant en de kwaliteitscontrole.
In deze studie presenteren we een verfijnde CUT&Tag strategie voor planten. We bieden niet alleen een stapsgewijs protocol voor H3K4me3-profilering in katoenbladeren, maar we bieden ook een geoptimaliseerde methodologie voor isolatie van plantenkernen, inclusief de strategie voor het selecteren van de concentratie van wasmiddel voor een goede cellyse en de strategie om de kernen te filteren. Gedetailleerde stappen met kritische opmerkingen zijn ook opgenomen in dit bijgewerkte protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we CUT & Tag beschreven, een technologie voor het genereren van DNA-bibliotheken met een hoge resolutie en een uitzonderlijk lage achtergrond met behulp van een klein aantal cellen met een vereenvoudigde procedure in vergelijking met chromatine-immunoprecipitatie (ChIP). Ons succes met H3K4me3-profilering in katoenbladeren suggereert dat CUT & Tag, dat voor het eerst werd ontworpen voor dierlijke cellen, ook kan worden gebruikt voor plantencellen. Zowel het Tris-buffersysteem dat vaak wordt gebruikt voor ChIP…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk financieel ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) en Fundamental Research Funds for the Central Universities, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) en het JCIC-MCP-project.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
