Profilage de la modification H3K4me3 dans les usines à l’aide du clivage sous cibles et de la marquage

Résumé

Le clivage sous les cibles et le marquage (CUT&Tag) est une stratégie efficace de profilage épigénomique de la chromatine. Ce protocole présente une stratégie CUT&Tag affinée pour le profilage des modifications des histones chez les plantes.

Résumé

La régulation épigénomique au niveau chromatique, y compris les modifications de l’ADN et des histones, les comportements des facteurs de transcription et les ARN non codants avec leurs protéines recrutées, conduisent à un contrôle temporel et spatial de l’expression des gènes. Le clivage sous cibles et marquage (CUT&Tag) est une méthode d’attachement enzymatique dans laquelle la protéine spécifique de chromatine est d’abord reconnue par son anticorps spécifique, puis l’anticorps attache une protéine de fusion A-transposase (pA-Tn5), qui clive la chromatine ciblée in situ par l’activation d’ions magnésium. Ici, nous fournissons notre protocole CUT&Tag précédemment publié en utilisant des noyaux intacts isolés à partir de feuilles de coton allortetraploïdes avec modification. Ce protocole étape par étape peut être utilisé pour la recherche épigénomique chez les plantes. En outre, des modifications substantielles pour l’isolement des noyaux végétaux sont accompagnées de commentaires critiques.

Introduction

Les sites d’ADN de liaison au facteur de transcription et la chromatine ouverte associée aux marques de modification des histones jouent un rôle fonctionnel essentiel dans la régulation de l’expression des gènes et constituent les principaux axes de recherche épigénétique1. Classiquement, le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) couplé au séquençage profond (ChIP-seq) a été utilisé pour l’identification à l’échelle du génome de la modification spécifique de l’histone de la chromatine ou de cibles d’ADN avec des protéines spécifiques, et est largement adopté dans le domaine de l’épigénétique2. La technologie ....

Protocole

1. Préparer la transposase et les solutions mères (Jour 1)

REMARQUE: Dans cette partie, les adaptateurs oligonucléotidiques sont complexés avec la transposase Tn5 pour rendre la transposase active.

1. Diluez les apprêts (apprêt A, apprêt B et apprêt C) jusqu’à une concentration de 100 μM à l’aide du tampon de recuit (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (voir le tableau 1 pour les informations de séquence des apprêts et le tableau 2 pour les recettes de solutions de travail). Conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
2. Mettre en place les deux réactions suivantes dans les ....

Résultats

La figure 1 illustre le flux de travail CUT&Tag. La figure 2 montre la coloration DAPI des noyaux intacts. L’objectif de l’étape « isolement des noyaux » était d’obtenir les noyaux intacts en quantité suffisante pour la réaction CUT&Tag ultérieure. La figure 3 montre l’électrophorèse sur gel d’agarose des produits de PCR. Le contrôle négatif IgG est requis en parallèle lors de la mise en place de l’expérience. Par rapport au.......

Discussion

Ici, nous avons décrit CUT&Tag, une technologie permettant de générer des bibliothèques d’ADN à haute résolution et en arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure simplifiée par rapport à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Notre succès avec le profilage H3K4me3 dans les feuilles de coton suggère que CUT&Tag, qui a d’abord été conçu pour les cellules animales, peut également être utilisé pour les cellules végétales. Le système tampon Tris couramment utilis.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
IgG de lapin normal	Millipore	12-370
Produits chimiques
Albumine sérique bovine (BSA)			Préparer 10 mg/ml de solution mère de BSA. Conserver à -20° ; C
digitonine (~50 % (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	Préparez une solution mère de digitonine à 5 % (200 mg de digitonine [~50 % de pureté] pour 2 mL de DMSO). Remarque : Stérilisez à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Conserver à -20° ; C
diméthylsulfoxyde (DMSO)
chloroforme
éthylènediamineacide tétraacétique (EDTA)			Produire 0,5 M EDTA (pH = 8,5) solution mère. Remarque : Pour fabriquer 100 ml d’EDTA 0,5-M (pH = 8,5), il faut environ 2 g de pastilles d’hydroxyde de sodium (NaOH) pour ajuster le pH de l’éthanol
Coprécipitant GlycoBlue (15 mg/mL)	Invitrogen	AM9516
chlorure de magnésium (MgCl2)			Make 1 M MgCl2 cocktail
d’inhibiteurs de protéase	Calbiochem	539133-1SET
chlorure de potassium (KCl)			Fabriquer 1 M de KCl solution mère
phénol :chloroforme :alcool isoamylique (25:24:1,v :v :v)
chlorure de sodium (NaCl)			Faire 5 M NaCl solution mère
spermidine			Fabriquer 2 M de spermidine solution mère, conserver à -20° ;C.
dodécylsulfate de sodium (SDS)Préparez			une solution mère SDS à 10 %. Remarque : Ne pas autoclaver ; stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 micron
Tris			Préparer 1 M de solution mère Tris (pH = 8,0)
Triton X-100			Préparer 20 % de solution mère Triton X-100
enzyme
hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase pour CUT& Tag	Vazyme	S602/S603	Vérifiez l’affinité des anticorps de la protéine A ou de la protéine G qui est fusionnée avec le Tn5. D’une manière générale, les protéines A et G ont une large affinité pour les anticorps. Cependant, la protéine A a une affinité relativement plus élevée pour les anticorps de lapin et la protéine G a une affinité relativement plus élevée pour les anticorps de souris. Sélectionnez les produits de transposase appropriés qui correspondent à votre anticorps.
TruePrep Amplify Enzyme	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5424R
PCR	Machine Applied Biosystems	ABI9700
Vibrateur orbital	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  ; spectrophotomètre	Thermo Scientific	ND-ONE-W

Base