Profilering av H3K4me3 Modifikasjon i planter ved hjelp av spalting under mål og tagmentering
Summary
Cleavage under mål og tagmentering (CUT&Tag) er en effektiv kromatin epigenomisk profileringsstrategi. Denne protokollen presenterer en raffinert CUT&Tag-strategi for profilering av histone modifikasjoner i planter.
Abstract
Epigenomisk regulering på kromatisk nivå, inkludert DNA- og histone-modifikasjoner, atferd av transkripsjonsfaktorer og ikke-kodende RNAer med sine rekrutterte proteiner, fører til tidsmessig og romlig kontroll av genuttrykk. Cleavage under mål og tagmentering (CUT&Tag) er en enzym-tethering metode der det spesifikke kromatinproteinet først gjenkjennes av sitt spesifikke antistoff, og deretter antistoffet tethers et protein A-transposase (pA-Tn5) fusjonsprotein, som klemmer det målrettede kromatin in situ ved aktivering av magnesiumioner. Her tilbyr vi vår tidligere publiserte CUT&Tag-protokoll ved hjelp av intakte kjerner isolert fra allortetraploid bomullsblader med modifikasjon. Denne trinnvise protokollen kan brukes til epigenomisk forskning i planter. I tillegg er betydelige modifikasjoner for plantekjerneisolasjon gitt kritiske kommentarer.
Introduction
Transkripsjonsfaktorbindende DNA-nettsteder og åpen kromatin assosiert med histone modifikasjonsmerker tjener kritiske funksjonelle roller i regulering av genuttrykk og er hovedfokus for epigenetisk forskning1. Konvensjonelt har kromatinimmunoprecipitation assay (ChIP) kombinert med dyp sekvensering (ChIP-seq) blitt brukt til genom-bred identifisering av spesifikk kromatin histone modifikasjon eller DNA-mål med spesifikke proteiner, og er allment vedtatt innen epigenetikk2. Cleavage under mål og tagmentation (CUT&Tag) teknologi ble opprinnelig utviklet av Henikoff Lab for å fange protein-tilknyttede DNA fragmenter gjennom genomet5. Sammenlignet med ChIP, genererer CUT&Tagcan DNA-biblioteker med høy oppløsning og eksepsjonelt lav bakgrunn ved hjelp av et lite antall celler med en forenklet prosedyre3. Til dags dato er det etablert metoder for analyse av kromatinregioner med spesifikke histone modifikasjoner ved hjelp av CUT&Tag i dyreceller4,5. Spesielt har single-cell CUT&Tag (scCUT&Tag) også blitt vellykket utviklet for humant vev og celler6. Men på grunn av kompleksiteten i celleveggen og sekundære metabolitter, er CUT&Tag fortsatt teknisk utfordrende for plantevev.
Tidligere rapporterte vi en CUT&Tag-protokoll ved hjelp av intakte kjerner isolert fra allotetraploid bomullsblader4. For å demonstrere effektiviteten av kjerneisolasjon og DNA-fangst ved hjelp av plantevev, presenteres profileringsprosedyren her. De viktigste trinnene inkluderer intakt kjerneisolasjon, in situ-inkubasjon med antistoffet for kromatinmodifisering, transposaseinkubasjon, adapterintegrasjon og DNA-bibliotekforberedelse. Feilsøkingen fokuserer på CUT&Tag-bibliotekets forberedelse til plantekjerneisolasjon og kvalitetskontroll.
I denne studien presenterer vi en raffinert CUT&Tag-strategi for planter. Ikke bare tilbyr vi en trinnvis protokoll for H3K4me3-profilering i bomullsblader, men vi tilbyr også en optimalisert metodikk for plantekjerneisolasjon, inkludert strategien for å velge konsentrasjonen av vaskemiddel for riktig cellelys og strategien for å filtrere kjernene. Detaljerte trinn med kritiske kommentarer er også inkludert i denne oppdaterte protokollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi beskrevet CUT&Tag, en teknologi for å generere DNA-biblioteker med høy oppløsning og eksepsjonelt lav bakgrunn ved hjelp av et lite antall celler med en forenklet prosedyre sammenlignet med kromatinimmunoprecipitation (ChIP). Vår suksess med H3K4me3 profilering i bomullsblader antyder at CUT&Tag, som først ble designet for dyreceller, også kan brukes til planteceller. Både Tris-buffersystemet som vanligvis brukes til ChIP-analyse8 og HEPES-buffersystemet som brukes til dyrs CUT&Tag-arbeid for CUT&Tag ve…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble økonomisk støttet delvis av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) og Fundamental Research Funds for Central Universities, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) og JCIC-MCP-prosjektet.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
