Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme Kullanılarak Bitkilerde H3K4me3 Modifikasyonunun Profillenmesi
Summary
Hedefler ve etiketleme altında bölünme (CUT&Tag) etkili bir kromatin epigenomik profilleme stratejisidir. Bu protokol, tesislerdeki histon modifikasyonlarının profillenmesi için rafine bir CUT&Tag stratejisi sunar.
Abstract
DNA ve histon modifikasyonları, transkripsiyon faktörlerinin davranışları ve işe alınan proteinleriyle kodlamayan RNA’lar dahil olmak üzere kromatik düzeyde epigenomik düzenleme, gen ekspresyonunun zamansal ve mekansal kontrolüne yol açar. Hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT & Tag), spesifik kromatin proteininin ilk önce spesifik antikoru tarafından tanındığı ve daha sonra antikorun, magnezyum iyonlarının aktivasyonu ile hedeflenen kromatini in situ olarak parçalayan bir protein A-transpozaz (pA-Tn5) füzyon proteinini bağladığı bir enzim-tethering yöntemidir. Burada, daha önce yayınlanmış CUT & Tag protokolümüzü, allortetraploid pamuk yapraklarından izole edilmiş bozulmamış çekirdekleri modifikasyonla kullanarak sunuyoruz. Bu adım adım protokol, bitkilerde epigenomik araştırmalar için kullanılabilir. Ek olarak, bitki çekirdeği izolasyonu için önemli değişiklikler kritik yorumlarla sağlanmaktadır.
Introduction
Transkripsiyon faktörü bağlayıcı DNA bölgeleri ve histon modifikasyon işaretleriyle ilişkili açık kromatin, gen ekspresyonunun düzenlenmesinde kritik fonksiyonel rollere hizmet eder ve epigenetik araştırmaların ana odak noktalarıdır1. Geleneksel olarak, kromatin immünopresipitasyon testi (ChIP), derin dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde, spesifik kromatin histon modifikasyonunun veya spesifik proteinlerle DNA hedeflerinin genom çapında tanımlanması için kullanılmıştır ve epigenetik alanında yaygın olarak benimsenmiştir2. Hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT&Tag) teknolojisi ilk olarak Henikoff Laboratuvarı tarafından genom boyunca proteine bağlı DNA fragmanlarını yakalamak için geliştirilmiştir5. ChIP ile karşılaştırıldığında, CUT&Tagcan basitleştirilmiş bir prosedürle az sayıda hücre kullanarak yüksek çözünürlükte ve son derece düşük arka planda DNA kütüphaneleri oluşturur3. Bugüne kadar, hayvan hücrelerinde CUT&Tag kullanılarak spesifik histon modifikasyonları olan kromatin bölgelerinin analizi için yöntemler oluşturulmuştur4,5. Özellikle, tek hücreli CUT&Tag (scCUT&Tag) insan dokuları ve hücreleri için de başarıyla geliştirilmiştir6. Bununla birlikte, hücre duvarının ve ikincil metabolitlerin karmaşıklığı nedeniyle, CUT & Tag bitki dokuları için teknik olarak hala zordur.
Daha önce, allotetraploid pamuk yapraklarından izole edilmiş sağlam çekirdekler kullanan bir CUT&Tag protokolü bildirmiştik4. Çekirdek izolasyonunun ve bitki dokusunu kullanarak DNA yakalamanın etkinliğini göstermek için, profilleme prosedürü burada sunulmuştur. Başlıca adımlar arasında bozulmamış çekirdek izolasyonu, kromatin modifikasyonu için antikor ile in situ inkübasyon, transpozaz inkübasyonu, adaptör entegrasyonu ve DNA kütüphanesi hazırlığı bulunmaktadır. Sorun giderme, tesis çekirdeği izolasyonu ve kalite kontrolü için CUT&Tag kütüphanesinin hazırlanmasına odaklanır.
Bu çalışmada, bitkiler için rafine bir CUT&Tag stratejisi sunuyoruz. Sadece pamuk yapraklarında H3K4me3 profillemesi için adım adım bir protokol sağlamakla kalmıyoruz, aynı zamanda uygun hücre lizisi için deterjan konsantrasyonunu seçme stratejisi ve çekirdekleri filtreleme stratejisi de dahil olmak üzere bitki çekirdeği izolasyonu için optimize edilmiş bir metodoloji sunuyoruz. Kritik yorumlar içeren ayrıntılı adımlar da bu güncellenmiş protokole dahil edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, kromatin immünopresipitasyonuna (ChIP) kıyasla basitleştirilmiş bir prosedürle az sayıda hücre kullanarak yüksek çözünürlükte ve son derece düşük arka planda DNA kütüphaneleri oluşturmak için bir teknoloji olan CUT & Tag’i tanımladık. Pamuk yapraklarında H3K4me3 profilleme ile elde ettiğimiz başarı, ilk olarak hayvan hücreleri için tasarlanan CUT&Tag’ın bitki hücreleri için de kullanılabileceğini göstermektedir. Hem ChIP testi8 için yaygın olarak kullan?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları, Hainan Yazhou Körfezi Tohum Laboratuvarı (JBGS, B21HJ0403), Çin Hainan İl Doğa Bilimleri Vakfı (320LH002) ve JCIC-MCP projesinden gelen hibelerle finansal olarak desteklenmiştir.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
