वैक्यूम-असिस्टेड सॉर्बेंट निष्कर्षण के साथ मानव-संबद्ध नमूनों से सक्रिय रूप से उत्पादित माइक्रोबियल वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों पर कब्जा करना
Summary
यह प्रोटोकॉल वैक्यूम-असिस्टेड सॉर्बेंट निष्कर्षण विधि के साथ एक जैविक नमूने से वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों के निष्कर्षण का वर्णन करता है, गैस क्रोमैटोग्राफी एनटेक नमूना तैयारी रेल का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित होता है, और डेटा विश्लेषण। यह जैविक नमूनों और स्थिर आइसोटोप जांच की संस्कृति का भी वर्णन करता है।
Abstract
जैविक नमूनों से वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों (वीओसी) की उत्पत्ति अज्ञात होती है। VOCs मेजबान के माइक्रोबियल समुदाय के भीतर से मेजबान या विभिन्न जीवों से उत्पन्न हो सकते हैं। माइक्रोबियल VOCs की उत्पत्ति को अलग करने के लिए, बैक्टीरियल मोनो के वाष्पशील हेडस्पेस विश्लेषण- और स्टैफिलोकोकस ऑरियस, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और एसिनेटोबैक्टर बाउमैनी की सह-संस्कृतियों, और मल, लार, सीवेज और थूक के जैविक नमूनों में स्थिर आइसोटोप जांच की गई थी। मोनो- और सह-संस्कृतियों का उपयोग व्यक्तिगत जीवाणु प्रजातियों से वाष्पशील उत्पादन की पहचान करने के लिए या जैविक नमूनों से रोगाणुओं के सक्रिय चयापचय की पहचान करने के लिए स्थिर आइसोटोप जांच के साथ संयोजन में किया गया था।
वैक्यूम-असिस्टेड सॉर्बेंट एक्सट्रैक्शन (वीएएसई) को वीओसी निकालने के लिए नियोजित किया गया था। VASE अर्ध-वाष्पशील और वाष्पशील यौगिकों के लिए एक आसान-से-उपयोग, व्यावसायीकृत, विलायक-मुक्त हेडस्पेस निष्कर्षण विधि है। सॉल्वैंट्स की कमी और निष्कर्षण के दौरान उपयोग की जाने वाली निकट-वैक्यूम स्थितियां एक विधि को अपेक्षाकृत आसान और तेज़ बनाती हैं जब अन्य निष्कर्षण विकल्पों जैसे कि टर्ट-ब्यूटिलेशन और ठोस चरण माइक्रोएक्सट्रैक्शन की तुलना में। यहां वर्णित वर्कफ़्लो का उपयोग मोनो- और सह-संस्कृतियों से विशिष्ट वाष्पशील हस्ताक्षरों की पहचान करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, मानव संबंधित जैविक नमूनों की स्थिर आइसोटोप जांच के विश्लेषण ने वीओसी की पहचान की जो या तो आमतौर पर या विशिष्ट रूप से उत्पादित किए गए थे। यह पेपर सामान्य वर्कफ़्लो और VASE के प्रयोगात्मक विचारों को लाइव माइक्रोबियल संस्कृतियों की स्थिर आइसोटोप जांच के साथ संयोजन के रूप में प्रस्तुत करता है।
Introduction
वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों (वीओसी) में बैक्टीरिया का पता लगाने और पहचान के लिए महान वादा है क्योंकि वे सभी जीवों से उत्सर्जित होते हैं, और विभिन्न रोगाणुओं में अद्वितीय वीओसी हस्ताक्षर होते हैं। वाष्पशील अणुओं का उपयोग विभिन्न श्वसन संक्रमणों का पता लगाने के लिए एक गैर-आक्रामक माप के रूप में किया गया है, जिसमें क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज1, मूत्र3 में तपेदिक2, और वेंटिलेटर से जुड़े निमोनिया4 शामिल हैं, इसके अलावा स्वस्थ नियंत्रण विषयों से सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) के साथ विषयों को अलग करने के लिए 5,6। वाष्पशील हस्ताक्षर का उपयोग सीएफ (स्टेफिलोकोकस ऑरियस7, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा 8,9, और एस ऑरियस बनाम पी एरुगिनोसा10) में विशिष्ट रोगज़नक़ संक्रमणों को अलग करने के लिए भी किया गया है। हालांकि, इस तरह के जैविक नमूनों की जटिलता के साथ, अक्सर विशिष्ट वीओसी के स्रोत को इंगित करना मुश्किल होता है।
कई संक्रमित रोगाणुओं से वाष्पशील प्रोफाइल को अलग करने के लिए एक रणनीति मोनो- और सह-संस्कृतिदोनों में सूक्ष्मजीवों के हेडस्पेस विश्लेषण करना है। हेडस्पेस विश्लेषण नमूने में एम्बेडेड लोगों के बजाय एक नमूने के ऊपर “हेडस्पेस” में उत्सर्जित एनालिस्ट की जांच करता है। माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स को अक्सर मोनो-संस्कृतियों में विशेषता दी गई है क्योंकि जटिल नैदानिक नमूनों में माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स की उत्पत्ति को निर्धारित करने में कठिनाई होती है। बैक्टीरियल मोनो-संस्कृतियों से वाष्पशील ों को प्रोफाइल करके, विट्रो में एक माइक्रोब द्वारा उत्पादित वाष्पशील के प्रकार इसके वाष्पशील प्रदर्शनों की सूची की एक आधार रेखा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। बैक्टीरियल संस्कृतियों का संयोजन, उदाहरण के लिए, सह-संस्कृतियों का निर्माण, और उत्पादित वाष्पशील अणुओं को प्रोफाइल करना बैक्टीरिया12 के बीच बातचीत या क्रॉस-फीडिंग को प्रकट कर सकता है।
वाष्पशील अणुओं की माइक्रोबियल उत्पत्ति की पहचान करने के लिए एक और रणनीति एक पोषक तत्व स्रोत प्रदान करना है जिसे एक स्थिर आइसोटोप के साथ लेबल किया गया है। स्थिर आइसोटोप स्वाभाविक रूप से होते हैं, न्यूट्रॉन की एक अलग संख्या के साथ परमाणुओं के गैर-रेडियोधर्मी रूप। एक रणनीति में जिसका उपयोग 1930 के दशक की शुरुआत से जानवरों में सक्रिय चयापचय का पता लगाने के लिए किया गया है,सूक्ष्मजीव लेबल किए गए पोषक तत्व स्रोत को बंद कर देता है और स्थिर आइसोटोप को अपने चयापचय मार्गों में शामिल करता है। हाल ही में, भारी पानी (डी2ओ) के रूप में एक स्थिर आइसोटोप का उपयोग नैदानिक सीएफ थूक नमूना14 में चयापचय रूप से सक्रिय एस ऑरियस की पहचान करने के लिए किया गया है। एक अन्य उदाहरण में, 13सी-लेबल वाले ग्लूकोज का उपयोग पी. एरुगिनोसा और रोथिया म्यूसिलागिनोसा12 के सीएफ नैदानिक आइसोलेट्स के बीच चयापचयों के क्रॉस-फीडिंग को प्रदर्शित करने के लिए किया गया है।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीकों की प्रगति के साथ, वाष्पशील संकेतों का पता लगाने के तरीके गुणात्मक टिप्पणियों से अधिक मात्रात्मक माप में चले गए हैं। गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) का उपयोग करके, जैविक नमूनों का प्रसंस्करण अधिकांश प्रयोगशाला या नैदानिक सेटिंग्स के लिए पहुंच के भीतर हो गया है। वाष्पशील अणुओं का सर्वेक्षण करने के लिए कई तरीकों का उपयोग नमूनों जैसे कि भोजन, जीवाणु संस्कृतियों और अन्य जैविक नमूनों, और संदूषण का पता लगाने के लिए हवा और पानी जैसे नमूनों को प्रोफाइल करने के लिए किया गया है। हालांकि, उच्च-थ्रूपुट के साथ वाष्पशील नमूने के कई सामान्य तरीकों को विलायक की आवश्यकता होती है और वैक्यूम निष्कर्षण द्वारा प्रदान किए गए लाभों के साथ प्रदर्शन नहीं किया जाता है। इसके अलावा, नमूना सामग्री की बड़ी मात्रा या मात्रा (0.5 मिलीलीटर से अधिक) अक्सर विश्लेषण15,16,17,18,19 के लिए आवश्यक होती है, हालांकि यह सब्सट्रेट-विशिष्ट है और प्रत्येक नमूना प्रकार और विधि के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है।
यहां, वैक्यूम-असिस्टेड सोर्बेंट एक्सट्रैक्शन (वीएएसई) के बाद जीसी-एमएस पर थर्मल डिसोर्प्शन को बैक्टीरियल मोनो- और सह-संस्कृतियों के वाष्पशील प्रोफाइल का सर्वेक्षण करने और मानव मल, लार, सीवेज और थूक के नमूनों से स्थिर आइसोटोप जांच के साथ सक्रिय रूप से उत्पादित वाष्पशील की पहचान करने के लिए नियोजित किया गया था (चित्रा 1)। सीमित नमूना मात्रा के साथ, VOCs थूक के 15 μL के रूप में कम से निकाले गए थे। मानव नमूनों के साथ आइसोटोप जांच प्रयोगों के लिए एक स्थिर आइसोटोप स्रोत को जोड़ने की आवश्यकता होती है, जैसे कि 13सी ग्लूकोज, और माइक्रोबियल समुदाय के विकास की खेती करने के लिए मीडिया। वाष्पशील के सक्रिय उत्पादन को जीसी-एमएस द्वारा एक भारी अणु के रूप में पहचाना गया था। एक स्थैतिक निर्वात के तहत वाष्पशील अणुओं के निष्कर्षण ने20,21,22 बढ़ी हुई संवेदनशीलता के साथ वाष्पशील अणुओं का पता लगाने में सक्षम बनाया।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो संस्कृतियों और मानव-संबद्ध नमूनों में वाष्पशील उत्पादन की पहचान करने के लिए, पी. एरुगिनोसा, एस. ऑरियस और ए. बाउमनी के मोनो- और सह-संस्कृतियों का वाष्पशील विश्लेषण किया गया और विभिन्न …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक संपादन के लिए हीथर मौघन और लिंडा एम. कालीकिन को धन्यवाद देते हैं। इस काम को NIH NHLBI (अनुदान 5R01HL136647-04) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can ‘rule-in’ Pseudomonas aeruginosa and ‘rule-out’ Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
