Gewinnung aktiv produzierter mikrobieller flüchtiger organischer Verbindungen aus humanassoziierten Proben mit vakuumgestützter Sorptionsmittelextraktion
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion flüchtiger organischer Verbindungen aus einer biologischen Probe mit der vakuumunterstützten Sorptionsextraktionsmethode, der Gaschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie unter Verwendung der Entech Sample Preparation Rail und der Datenanalyse. Es beschreibt auch die Kultur biologischer Proben und die Untersuchung stabiler Isotopen.
Abstract
Flüchtige organische Verbindungen (VOC) aus biologischen Proben haben unbekannte Ursprünge. VOCs können vom Host oder von verschiedenen Organismen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft des Wirts stammen. Um den Ursprung mikrobieller VOCs zu entwirren, wurden flüchtige Kopfraumanalysen von bakteriellen Mono- und Co-Kulturen von Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii sowie stabile Isotopenuntersuchungen in biologischen Proben von Kot, Speichel, Abwasser und Sputum durchgeführt. Mono- und Co-Kulturen wurden verwendet, um die flüchtige Produktion einzelner Bakterienspezies zu identifizieren oder in Kombination mit stabiler Isotopensondierung, um den aktiven Stoffwechsel von Mikroben aus den biologischen Proben zu identifizieren.
Vakuum-unterstützte Sorptionsmittelextraktion (VASE) wurde verwendet, um die VOCs zu extrahieren. VASE ist ein einfach zu bedienendes, kommerzialisiertes, lösungsmittelfreies Headspace-Extraktionsverfahren für halbflüchtige und flüchtige Verbindungen. Der Mangel an Lösungsmitteln und die während der Extraktion verwendeten Beivakuumbedingungen machen die Entwicklung einer Methode im Vergleich zu anderen Extraktionsoptionen wie Tert-Butylierung und Festphasen-Mikroextraktion relativ einfach und schnell. Der hier beschriebene Workflow wurde verwendet, um spezifische flüchtige Signaturen aus Mono- und Co-Kulturen zu identifizieren. Darüber hinaus identifizierte die Analyse der stabilen Isotopenuntersuchung von humanassoziierten biologischen Proben VOCs, die entweder üblicherweise oder einzigartig produziert wurden. Dieses Papier präsentiert den allgemeinen Arbeitsablauf und die experimentellen Überlegungen von VASE in Verbindung mit der Untersuchung stabiler Isotopen lebender mikrobieller Kulturen.
Introduction
Flüchtige organische Verbindungen (VOCs) sind vielversprechend für den bakteriellen Nachweis und die Identifizierung, da sie von allen Organismen emittiert werden und verschiedene Mikroben einzigartige VOC-Signaturen haben. Flüchtige Moleküle wurden als nicht-invasive Messung zum Nachweis verschiedener Atemwegsinfektionen verwendet, einschließlich chronisch obstruktiver Lungenerkrankung1, Tuberkulose2 im Urin3 und beatmungsassoziierter Pneumonie4, zusätzlich zur Unterscheidung von Probanden mit Mukoviszidose (CF) von gesunden Kontrollpersonen 5,6. Flüchtige Signaturen wurden sogar verwendet, um spezifische Erregerinfektionen bei CF zu unterscheiden (Staphylococcus aureus 7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 und S. aureus vs. P. aeruginosa10). Angesichts der Komplexität solcher biologischer Proben ist es jedoch oft schwierig, die Quelle spezifischer VOCs zu lokalisieren.
Eine Strategie zur Entflechtung der flüchtigen Profile von mehreren infizierenden Mikroben besteht darin, eine Headspace-Analyse von Mikroorganismen sowohl in Mono- als auch in Co-Kulturdurchzuführen 11. Die Headspace-Analyse untersucht die Analyten, die in den “Headspace” über einer Probe emittiert werden, und nicht diejenigen, die in die Probe selbst eingebettet sind. Mikrobielle Metaboliten wurden oft in Monokulturen charakterisiert, da es schwierig ist, den Ursprung mikrobieller Metaboliten in komplexen klinischen Proben zu bestimmen. Durch die Profilierung flüchtiger Stoffe aus bakteriellen Monokulturen können die Arten von flüchtigen Stoffen, die eine Mikrobe in vitro produziert, eine Grundlage ihres flüchtigen Repertoires darstellen. Die Kombination von Bakterienkulturen, z. B. die Bildung von Co-Kulturen, und die Profilierung der produzierten flüchtigen Moleküle kann die Wechselwirkungen oder die gegenseitige Fütterung zwischen den Bakterienaufdecken 12.
Eine weitere Strategie zur Identifizierung des mikrobiellen Ursprungs flüchtiger Moleküle besteht darin, eine Nährstoffquelle bereitzustellen, die mit einem stabilen Isotop markiert ist. Stabile Isotope sind natürlich vorkommende, nicht radioaktive Formen von Atomen mit einer unterschiedlichen Anzahl von Neutronen. In einer Strategie, die seit den frühen 1930er Jahren verwendet wird, um den aktiven Stoffwechsel bei Tieren13 zu verfolgen, ernährt sich der Mikroorganismus von der markierten Nährstoffquelle und integriert das stabile Isotop in seine Stoffwechselwege. In jüngerer Zeit wurde ein stabiles Isotop in Form von schwerem Wasser (D2O) verwendet, um metabolisch aktiven S. aureus in einer klinischen CF-Sputumprobe14 zu identifizieren. In einem anderen Beispiel wurde 13C-markierte Glukose verwendet, um das Cross-Feed von Metaboliten zwischen CF-klinischen Isolaten von P. aeruginosa und Rothia mucilaginosa12 zu demonstrieren.
Mit der Weiterentwicklung der Massenspektrometrietechniken haben sich die Methoden zum Nachweis flüchtiger Hinweise von qualitativen Beobachtungen zu quantitativeren Messungen entwickelt. Durch den Einsatz der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) ist die Verarbeitung biologischer Proben für die meisten Labor- oder klinischen Umgebungen in Reichweite gekommen. Viele Methoden zur Untersuchung flüchtiger Moleküle wurden verwendet, um Proben wie Lebensmittel, Bakterienkulturen und andere biologische Proben sowie Luft und Wasser zum Nachweis von Kontaminationen zu profilieren. Einige gängige Methoden der flüchtigen Probenahme mit hohem Durchsatz erfordern jedoch Lösungsmittel und werden nicht mit den Vorteilen der Vakuumextraktion durchgeführt. Darüber hinaus sind für die Analyse 15,16,17,18,19 häufig größere Volumina oder Mengen (größer als 0,5 ml) an beprobten Materialien erforderlich, obwohl dies substratspezifisch ist und eine Optimierung für jeden Probentyp und jede Methode erfordert.
Hier wurde die vakuumunterstützte Sorptionsmittelextraktion (VASE) mit anschließender thermischer Desorption auf einer GC-MS eingesetzt, um die flüchtigen Profile bakterieller Mono- und Co-Kulturen zu untersuchen und aktiv produzierte flüchtige Stoffe mit stabiler Isotopensondierung aus menschlichen Kot-, Speichel-, Abwasser- und Sputumproben zu identifizieren (Abbildung 1). Mit begrenzten Probenmengen wurden VOCs aus nur 15 μL Sputum extrahiert. Isotopenuntersuchungsexperimente mit menschlichen Proben erforderten die Zugabe einer stabilen Isotopenquelle wie 13-C-Glukoseund Medien, um das Wachstum der mikrobiellen Gemeinschaft zu kultivieren. Die aktive Produktion von flüchtigen Stoffen wurde von GC-MS als schwereres Molekül identifiziert. Die Extraktion flüchtiger Moleküle unter statischem Vakuum ermöglichte den Nachweis flüchtiger Moleküle mit erhöhter Empfindlichkeit20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zur Identifizierung der flüchtigen Produktion in In-vitro-Kulturen und humanassoziierten Proben wurden flüchtige Analysen von Mono- und Co-Kulturen von P. aeruginosa, S. aureus und A. baumanii sowie stabile Isotopenuntersuchungen verschiedener biologischer Proben durchgeführt. In der Analyse für die Mono- und Co-Kulturen wurden flüchtige Stoffe durch eine kurze Extraktion für 1 h bei 70 °C nachgewiesen. Die flüchtige Analyse von Mono- und Co-Kulturen ermöglichte die Untersuchung der V…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Heather Maughan und Linda M. Kalikin für die sorgfältige Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom NIH NHLBI (Grant 5R01HL136647-04) unterstützt.
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
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