चुंबकीय उत्तोलन का उपयोग करके सेलुलर घनत्व और एंटीजेनिक गुणों का मात्राकरण
Summary
यह पत्र एक चुंबकीय उत्तोलन-आधारित विधि का वर्णन करता है जो विशेष रूप से निश्चित घनत्व के साथ कैप्चर मोतियों की उत्तोलन ऊंचाई में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करके, घुलनशील या झिल्ली से बंधे एंटीजन की उपस्थिति का पता लगा सकता है।
Abstract
वर्णित विधि चुंबकीय उत्तोलन के सिद्धांतों के आधार पर विकसित की गई थी, जो कोशिकाओं और कणों को उनके घनत्व और चुंबकीय गुणों के आधार पर अलग करती है। घनत्व एक सेल प्रकार है जो संपत्ति की पहचान करता है, जो सीधे इसकी मेटाबॉलिक दर, भेदभाव और सक्रियण स्थिति से संबंधित है। चुंबकीय उत्तोलन सफलतापूर्वक अलग करने के लिए एक कदम दृष्टिकोण की अनुमति देता है, छवि और परिसंचारी रक्त कोशिकाओं की विशेषता है, और एनीमिया, सिकल सेल रोग का पता लगाने के लिए, और घनत्व और चुंबकीय गुणों के आधार पर ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी । यह दृष्टिकोण क्रमशः कैप्चर और डिटेक्शन एंटीबॉडी के साथ लेपित कम और उच्च घनत्व वाले मोतियों के सेट का उपयोग करके समाधान में मौजूद घुलनशील एंटीजन का पता लगाने के लिए भी उत्तरदायी है। यदि एंटीजन समाधान में मौजूद है, तो यह मोतियों के दो सेटों को पाटदेगा, एक नया मनका-मनका परिसर उत्पन्न करेगा, जो एंटीबॉडी-लेपित मोतियों की पंक्तियों के बीच में उड़ जाएगा। समाधान में लक्ष्य एंटीजन की बढ़ी हुई एकाग्रता एंटीजन की कम सांद्रता की तुलना में बड़ी संख्या में मनका-मनका परिसरों को उत्पन्न करेगी, इस प्रकार लक्ष्य एंटीजन के मात्रात्मक मापन की अनुमति देगी। चुंबकीय उत्तोलन अपने कम नमूना तैयारी समय और शास्त्रीय readout तरीकों पर निर्भरता की कमी के कारण अन्य तरीकों के लिए लाभप्रद है। उत्पादित छवि को आसानी से एक मानक माइक्रोस्कोप या मोबाइल डिवाइस, जैसे स्मार्टफोन या टैबलेट का उपयोग करके कैप्चर और विश्लेषण किया जाता है।
Introduction
चुंबकीय उत्तोलन एक तकनीक है जो सेल प्रकार1, 2, 3,प्रोटीन4,5और ओपिओइड 6 को अलग, विश्लेषण और पहचानने के लिए विकसित की गई है जो पूरीतरह से उनके विशिष्ट घनत्व और पैरामैग्नेटिक गुणों पर आधारित है। कोशिका घनत्व प्रत्येक कोशिका प्रकार की एक अनूठी, आंतरिक संपत्ति है जो सीधे तौर पर इसकीमेटाबॉलिक दर और भेदभाव की स्थिति7, 8,9,10,11,12,13,14से संबंधित है । स्थिर राज्य की स्थितियों के दौरान सेल घनत्व में सूक्ष्म और क्षणिक परिवर्तनों की मात्रा, और विभिन्न प्रकार की कोशिका प्रक्रियाओं के दौरान, सेल फिजियोलॉजी और रोगविज्ञान में एक बेजोड़ अंतर्दृष्टि का खर्च उठा सकता है। कोशिका घनत्व में परिवर्तन कोशिका विभेदन15,16,कोशिका चक्रप्रगति9,17, 18,19,एपोप्टोसिस20, 21,22,23,और घातक परिवर्तन24,25, 26से जुड़ेहुए हैं। . इसलिए, कोशिका घनत्व में विशिष्ट परिवर्तनों की मात्रा का उपयोग विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच अंतर करने के साथ-साथ विभिन्न सक्रियण प्रक्रियाओं से गुजरने वाली कोशिकाओं के समान प्रकार के बीच भेदभाव करने के लिए किया जा सकता है। यह उन प्रयोगों को सक्षम बनाता है जो एक विशेष कोशिका उप-आबादी को लक्षित करते हैं, जहां घनत्व में गतिशील परिवर्तन परिवर्तित सेल मेटाबोलिज्म27के संकेतक के रूप में कार्य करता है। जैसा कि यह स्थापित किया गया है कि एक कोशिका बदलते वातावरण के जवाब में अपने घनत्व को बदल सकती है, इसे पूरी तरह से समझने के लिएइसकेघनत्व के संबंध में कोशिका की गतिज को मापना अनिवार्य है, जो वर्तमान तरीके12प्रदान नहीं कर सकते हैं। दूसरी ओर चुंबकीय उत्तोलन, कोशिकाओं और उनके गुणों के गतिशील मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है28।
कोशिकाएं डायमैग्नेटिक हैं जिसका अर्थ है कि उनके पास स्थायी चुंबकीय डाइपोल पल नहीं है। हालांकि, जब एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र के संपर्क में, एक कमजोर चुंबकीय डाइपोल पल कोशिकाओं में उत्पन्न होता है, लागू क्षेत्र की विपरीत दिशा में। इस प्रकार, यदि कोशिकाओं को एक पैरामैग्नेटिक समाधान में निलंबित कर दिया जाता है और एक मजबूत ऊर्ध्वाधर चुंबकीय क्षेत्र के संपर्क में आता है, तो वे चुंबकीय स्रोत से दूर हो जाएंगे और ऊंचाई तक रुक जाएंगे, जो मुख्य रूप से उनके व्यक्तिगत घनत्व पर निर्भर करता है। एक असंगत चुंबकीय क्षेत्र के ंयूनतम तक ही सीमित एक वस्तु का मंद चुम्बकीय उत्तोलन संभव है जब दो निम्नलिखित मानदंडों को पूरा कर रहे हैं: 1) कण की चुंबकीय संवेदनशीलता आसपास के माध्यम की तुलना में छोटा होना चाहिए, और 2) चुंबकीय बल कण के उछाल बल को संतुलित करने के लिए काफी मजबूत होना चाहिए । दोनों मानदंडों को चुंबकीय बफर में आरबीसी को निलंबित करके और छोटे, सस्ती, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध स्थायी मैग्नेट1के साथ मजबूत चुंबकीय क्षेत्र ढाल बनाकर पूरा किया जा सकता है। गुरुत्वाकर्षण की दिशा में धुरी पर चुंबकीय रूप से फंसे कण की संतुलन की स्थिति इसके घनत्व (बफर के घनत्व के सापेक्ष), इसकी चुंबकीय संवेदनशीलता (बफर की चुंबकीय संवेदनशीलता के सापेक्ष) और एक लागू चुंबकीय क्षेत्र के हस्ताक्षर से निर्धारित होती है। चूंकि समाधान के घनत्व और चुंबकीय गुण पूरे सिस्टम में स्थिर हैं, कोशिकाओं के आंतरिक घनत्व गुण कोशिकाओं की उत्तोलन ऊंचाई का निर्धारण करने वाले प्रमुख कारक होंगे, जिसमें डेंजर कोशिकाएं कम घने कोशिकाओं की तुलना में कम उड़ती हैं। यह दृष्टिकोण दो घनत्व संदर्भ मोतियों (1.05 और 1.2 ग्राम/एमएल) के एक सेट का उपयोग करता है जो हमें घनत्व मापन के लिए सटीक, अनुपातमेषिक विश्लेषण का उपयोग करने की अनुमति देता है। चुंबकीय समाधान की एकाग्रता में फेरबदल एक विभिन्न सेलुलर आबादी को अलग करने की अनुमति देता है, जैसे WBCs से आरबीसी, परिसंचारी कोशिकाओं का घनत्व सेल विशिष्ट है, अलगाव प्रोटोकॉल या अन्य सेल हेरफेर की आवश्यकता को हटा रहा है।
जीव विज्ञान अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश पहचान विधियों विशिष्ट बाध्यकारी घटनाओं के बहिष्करण पर निर्भर करते हैं ताकि रैखिक संकेतों की मात्रा आसान हो सके। ये रीडआउट विधियां अक्सर जटिल होती हैं और इसमें विशेष उपकरण और समर्पित वैज्ञानिक कर्मी शामिल होते हैं। कोशिकाओं या बाहुलर वेसिकल्स की प्लाज्मा झिल्ली पर या जो प्लाज्मा में घुलनशील हैं, या तो एक या दो एंटीबॉडी लेपित मोतियों का उपयोग करके, यहां वर्णित है, एंटीजन का पता लगाने के उद्देश्य से एक दृष्टिकोण। मोती एक दूसरे से और पूछताछ लक्ष्यों के उन लोगों से अलग घनत्व के होना चाहिए । किसी भी बायोफ्लुइड में लक्ष्य एंटीजन की उपस्थिति को एंटीजन-पॉजिटिव सेल की उत्तोलन ऊंचाई में एक विशिष्ट, मापने योग्य परिवर्तन में अनुवादित किया जाता है जो एक डिटेक्शन मनका से बंधा होता है। घुलनशील एंटीजन या बाहुलर वेसिकल्स के मामले में, वे मनका-सेल परिसर के बजाय मनका-मनका परिसर बनाने, कैप्चर और डिटेक्शन मोतियों दोनों से बंधे होते हैं। उत्तोलन ऊंचाई में परिवर्तन मनका-कोशिका या मनका-मनका परिसरों के नए घनत्व पर निर्भर करता है। परिसरों की उत्तोलन ऊंचाई में परिवर्तन के अलावा, जो बायोफ्लुइड में एंटीजन की उपस्थिति को इंगित करता है, परिसरों की संख्या भी लक्ष्य की मात्रा पर निर्भर है, जिससे चुंबकीय उत्तोलन भी एंटीजन डिटेक्शन24के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण बन गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ढाल अपकेंद्रित्र वर्तमान में उनके अद्वितीय घनत्व के आधार पर उपकोशिकीय घटकों को अलग करने के लिए मानक तकनीक है। हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए विशेष ढाल वाले मीडिया के साथ-साथ अपकेंद्रित्र उपकरणों के उपय?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक डॉ गीतालियो परेरा को एक्सट्रासेलुलर वेसिकल वर्क के साथ मदद के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।
इस काम को आईसीजी को निम्नलिखित राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था: RO1CA218500, UG3HL147353, और UG3TR002881।
Materials
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
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