Fremstilling av menneskelig vev innebygd i optimal skjæretemperaturforbindelse for massespektrometrianalyse
Summary
Sfingolipider er bioaktive metabolitter med veletablerte roller i human sykdom. Karakterisering av endringer i vev med massespektrometri kan avsløre roller i sykdomsetiologi eller identifisere terapeutiske mål. Imidlertid forstyrrer OCT-forbindelsen som brukes til kryopreservering i biorepositorier massespektrometri. Vi skisserer metoder for å analysere sfingolipider i humant vev innebygd i OCT med LC-ESI-MS / MS.
Abstract
Sfingolipider er cellulære komponenter som har veletablerte roller i menneskelig metabolisme og sykdom. Massespektrometri kan brukes til å bestemme om sfingolipider endres i en sykdom og undersøke om sfingolipider kan målrettes klinisk. Imidlertid kan riktig drevne prospektive studier som anskaffer vev direkte fra kirurgisk suite være tidkrevende og teknisk, logistisk og administrativt utfordrende. I motsetning til dette kan retrospektive studier dra nytte av kryopreserverte menneskelige prøver som allerede er tilgjengelige, vanligvis i stort antall, ved vevsbiorepositorier. Andre fordeler ved å anskaffe vev fra biorepositorier inkluderer tilgang til informasjon knyttet til vevsprøver, inkludert histologi, patologi og i noen tilfeller kliniskpatologiske variabler, som alle kan brukes til å undersøke korrelasjoner med lipidomikkdata. Imidlertid er tekniske begrensninger knyttet til inkompatibiliteten til optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) som brukes i kryopreservering og massespektrometri en teknisk barriere for analyse av lipider. Imidlertid har vi tidligere vist at OCT lett kan fjernes fra humane biorepository prøver gjennom sykluser av vasker og sentrifugering uten å endre deres sfingolipidinnhold. Vi har også tidligere fastslått at sfingolipider i humant vev kryopreservert i OCT er stabile i opptil 16 år. I denne rapporten skisserer vi trinnene og arbeidsflyten for å analysere sfingolipider i humane vevsprøver som er innebygd i OCT, inkludert vasking av vev, veiing av vev for datanormalisering, ekstraksjon av lipider, fremstilling av prøver for analyse ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandemmassespektrometri (LC-ESI-MS / MS), massespektrometridataintegrasjon, datanormalisering og dataanalyse.
Introduction
Sfingolipider er bioaktive metabolitter kjent for sine roller i human metabolisme og sykdom 1,2. De regulerer komplekse cellulære prosesser som cellemigrasjon, celleoverlevelse og død, cellebevegelse, vesikulær handel, cellulær invasjon og metastase, angiogenese og produksjon av cytokiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekter i reguleringen av sfingolipidmetabolisme bidrar til initiering og progresjon av kreft, bestemmer hvor aggressive kreftformer er, og hvordan kreft reagerer på og utvikler motstand mot terapi 3,10. Derfor, på grunn av disse brede effektene på sykdommens etiologi, er analytiske metoder som nettopp kan etablere sykdomsspesifikke sfingolipidendringer, viktige verktøy. Massespektrometri (MS) er den mest nøyaktige og pålitelige metoden for å analysere sfingolipidendringer.
Humane prøver som kan brukes til analyse av sfingolipidendringer, kan oppnås prospektivt fra kirurgisk suite eller retrospektivt fra vevsbiorepositorier. Friskt vev fra kirurgi er fordelaktig fordi de kan analyseres direkte ved MS eller andre analysemetoder. Imidlertid har anskaffelse av vev prospektivt administrative, tekniske og logistiske hindringer, og det kan være utfordrende å samle tilstrekkelige prøver for å nå statistisk styrke. Innhenting av vev fra biorepositorier er fordelaktig fordi de kan anskaffes retrospektivt, i stort antall, og biorepositorier bekrefter histologi og patologi, bruker standard operasjonsprosedyrer for å kryogenisk bevare og lagre vev, og kan gi kliniskpatologiske data som kan brukes til korrelasjonsanalyser. For å bevare molekylære og strukturelle egenskaper kan biorepositorier imidlertid kryopreservere vev ved å legge dem inn i optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse, som vi har vist forstyrrer datanormaliseringsanalyser og kvantifisering av sfingolipider ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS)11 . Det har også vist seg at polyvinylalkohol og polyetylenglykol, de primære komponentene i OCT-forbindelsen, resulterer i ionundertrykkelse i andre MS-analyseplattformer12,13,14,15. Derfor må OCT-forbindelsen fjernes fra vev før sfingolipidomisk analyse ved MS.
I en tidligere rapport har vi validert en protokoll for fjerning av OCT-forbindelse fra humane prøver for LC-ESI-MS / MS-analyse11 og metoden som brukes for veiing av vev for datanormalisering11. Her beskriver vi trinnene i den sfingolipidomiske OCT-forbindelsesfjerningsprotokollen (sOCTrP) og viser representative data fra humane lungeadenokarsinomtumorer og normale tilstøtende uinvolverte vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT er et vanlig langsiktig kryo-bevaringsmiddel som brukes i biorepositorier. OCT kan imidlertid resultere i ioneundertrykkelse når vev analyseres av forskjellige massespektrometriplattformer12,13,14,15, eller resultere i tap av signal når prøver analyseres av LC-ESI-MS / MS 11. OCT i kryopreservert vev kan også forstyrre vevsnormaliseringsmetoder som veiing og prot…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tjenester og støtte til forskningsprosjektet ble levert av VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core og VCU Lipidomics and Metabolomics Core, som støttes delvis med finansiering fra NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. . Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
