用于质谱分析的最佳切割温度化合物中嵌入的人组织制备
Summary
鞘脂是生物活性代谢物，在人类疾病中具有公认的作用。用质谱法表征组织改变可以揭示疾病病因学中的作用或确定治疗靶点。然而，用于生物储存库中冷冻保存的OCT化合物会干扰质谱分析。我们概述了使用LC-ESI-MS / MS分析嵌入OCT的人体组织中鞘脂的方法。
Abstract
鞘脂是在人体新陈代谢和疾病中具有明确作用的细胞成分。质谱可用于确定鞘脂在疾病中是否改变，并研究鞘脂是否可以在临床上靶向。然而，直接从手术室获取组织的适当把握度的前瞻性研究可能非常耗时，并且在技术、后勤和行政上具有挑战性。相比之下，回顾性研究可以利用组织生物储存库中已经存在的冷冻保存的人类标本，通常数量很大。从生物储存库采购组织的其他优点包括访问与组织标本相关的信息，包括组织学、病理学以及在某些情况下的临床病理学变量，所有这些都可用于检查与脂质组学数据的相关性。然而，与冷冻保存和质谱中使用的最佳切割温度化合物（OCT）不相容相关的技术限制是脂质分析的技术障碍。然而，我们之前已经证明，OCT可以通过洗涤和离心的循环轻松地从人类生物储存库标本中去除，而不会改变其鞘脂含量。我们之前还确定，在OCT中冷冻保存的人体组织中的鞘脂可以稳定长达16年。在本报告中，我们概述了分析嵌入OCT的人组织标本中鞘脂的步骤和工作流程，包括洗涤组织，称量组织以进行数据归一化，脂质提取，制备用于液相色谱电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS / MS）分析的样品，质谱数据集成，数据归一化和数据分析。
Introduction
鞘脂是生物活性代谢物，以其在人体代谢和疾病中的作用而闻名1，2。它们调节复杂的细胞过程，如细胞迁移、细胞存活和死亡、细胞运动、囊泡运输、细胞侵袭和转移、血管生成以及细胞因子的产生1，2，3，4，5，6，7，8，9.鞘脂代谢调节的缺陷有助于癌症的发生和进展，决定癌症的侵袭性，以及癌症如何对治疗产生反应和耐药性3，10。因此，由于这些对疾病病因的广泛影响，能够精确确定疾病特异性鞘脂改变的分析方法是重要的工具。质谱（MS）是分析鞘脂改变的最准确和可靠的方法。
可用于分析鞘脂改变的人类标本可以从手术室前瞻性地获得，也可以从组织生物储存库中回顾性地获得。来自手术的新鲜组织是有利的，因为它们可以通过MS或其他分析方法直接分析。然而，前瞻性地获取组织存在行政、技术和后勤障碍，收集足够的标本以达到统计能力可能具有挑战性。从生物储存库获取组织是有利的，因为它们可以回顾性地大量获取，并且生物储存库确认组织学和病理学，使用标准操作程序低温保存和储存组织，并且可以提供可用于相关性分析的临床病理学数据。然而，为了保留分子和结构特征，生物储存库可以通过将组织嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物来冷冻保存组织，我们已经证明这会干扰数据归一化测定和通过液相色谱电喷雾串联质谱 （LC-ESI-MS/MS） 对鞘脂的定量11.还表明，聚乙烯醇和聚乙二醇（OCT化合物中的主要成分）在其他MS分析平台中导致离子抑制12，13，14，15。因此，在通过MS进行鞘脂组学分析之前，必须从组织中去除OCT化合物。
在之前的报告中，我们验证了从人类标本中去除OCT化合物的方案，用于LC-ESI-MS/MS分析11 ，以及用于称量组织以进行数据归一化的方法11。在这里，我们详细介绍了鞘脂组OCT化合物去除方案（sOCTrP）的步骤，并显示了来自人肺腺癌肿瘤和正常邻近未受累组织的代表性数据。
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT是一种常见的长期冷冻保存剂，用于生物储存库。然而，当通过各种质谱平台12、13、14、15分析组织时，OCT会导致离子抑制，或者当通过LC-ESI-MS/MS11分析样品时，会导致信号丢失。冷冻保存组织中的OCT也会干扰组织标准化方法，例如称量和蛋白质定量测定，例如Bradford和BCA<sup class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该研究项目的服务和支持由VCU Massey癌症中心组织和数据采集和分析核心以及VCU脂质组学和代谢组学核心提供，部分资金来自NIH-NCI癌症中心支持拨款P30CA016059。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R21CA232234（圣地亚哥利马）的支持。
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
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