Préparation de tissus humains incorporés dans un composé à température de coupe optimale pour analyse par spectrométrie de masse
Summary
Les sphingolipides sont des métabolites bioactifs dont le rôle dans les maladies humaines est bien établi. La caractérisation des altérations dans les tissus par spectrométrie de masse peut révéler des rôles dans l’étiologie de la maladie ou identifier des cibles thérapeutiques. Cependant, le composé OCT utilisé pour la cryoconservation dans les dépôts biologiques interfère avec la spectrométrie de masse. Nous décrivons des méthodes pour analyser les sphingolipides dans les tissus humains incorporés dans la TCO avec LC-ESI-MS/MS.
Abstract
Les sphingolipides sont des composants cellulaires qui ont des rôles bien établis dans le métabolisme humain et la maladie. La spectrométrie de masse peut être utilisée pour déterminer si les sphingolipides sont altérés dans une maladie et déterminer si les sphingolipides peuvent être ciblés cliniquement. Cependant, les études prospectives de bonne puissance qui acquièrent des tissus directement à partir de la salle d’opération peuvent prendre beaucoup de temps et être difficiles sur les plans technique, logistique et administratif. En revanche, les études rétrospectives peuvent tirer parti des spécimens humains cryoconservés déjà disponibles, généralement en grand nombre, dans les dépôts biologiques tissulaires. Parmi les autres avantages de l’obtention de tissus auprès de dépôts biologiques, mentionnons l’accès à l’information associée aux échantillons de tissus, y compris l’histologie, la pathologie et, dans certains cas, les variables clinicopathologiques, qui peuvent toutes être utilisées pour examiner les corrélations avec les données lipidomiques. Cependant, les limitations techniques liées à l’incompatibilité du composé à température de coupe optimale (OCT) utilisé dans la cryoconservation et la spectrométrie de masse constituent une barrière technique pour l’analyse des lipides. Cependant, nous avons déjà montré que la TCO peut être facilement retirée des échantillons humains de biodépôts par des cycles de lavage et de centrifugation sans modifier leur teneur en sphingolipides. Nous avons également précédemment établi que les sphingolipides dans les tissus humains cryoconservés en OCT sont stables jusqu’à 16 ans. Dans ce rapport, nous décrivons les étapes et le flux de travail pour analyser les sphingolipides dans les échantillons de tissus humains qui sont intégrés dans l’OCT, y compris le lavage des tissus, le pesage des tissus pour la normalisation des données, l’extraction des lipides, la préparation des échantillons pour analyse par chromatographie liquide spectrométrie de masse en tandem par électropulvérisation (LC-ESI-MS / MS), l’intégration des données de spectrométrie de masse, la normalisation des données et l’analyse des données.
Introduction
Les sphingolipides sont des métabolites bioactifs connus pour leurs rôles dans le métabolisme humain et la maladie 1,2. Ils régulent des processus cellulaires complexes tels que la migration cellulaire, la survie et la mort cellulaires, le mouvement cellulaire, le trafic vésiculeux, l’invasion cellulaire et les métastases, l’angiogenèse et la production de cytokines 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Les défauts dans la régulation du métabolisme des sphingolipides contribuent à l’initiation et à la progression des cancers, déterminent l’agressivité des cancers et la façon dont les cancers répondent et développent une résistance au traitement 3,10. Par conséquent, en raison de ces vastes répercussions sur l’étiologie de la maladie, les méthodes analytiques qui permettent d’établir avec précision les altérations des sphingolipides spécifiques à la maladie sont des outils importants. La spectrométrie de masse (SM) est la méthode la plus précise et la plus fiable pour analyser les altérations des sphingolipides.
Les échantillons humains qui peuvent être utilisés pour l’analyse des altérations des sphingolipides peuvent être obtenus prospectivement à partir de la salle d’opération ou rétrospectivement à partir de biodépôts tissulaires. Les tissus frais issus de la chirurgie sont avantageux parce qu’ils peuvent être analysés directement par la SEP ou d’autres méthodes analytiques. Cependant, l’acquisition prospective de tissus comporte des obstacles administratifs, techniques et logistiques, et la collecte de suffisamment de spécimens pour atteindre la puissance statistique peut être difficile. L’obtention de tissus auprès de dépôts biologiques est avantageuse parce qu’ils peuvent être acquis rétrospectivement, en grand nombre, et les biodépôts confirment l’histologie et la pathologie, utilisent des procédures opérationnelles normalisées pour préserver et stocker cryogéniquement les tissus, et peuvent fournir des données clinicopathologiques qui peuvent être utilisées pour les analyses de corrélation. Cependant, pour préserver les caractéristiques moléculaires et structurelles, les biodépôts peuvent cryopréserver les tissus en les incorporant dans un composé à température de coupe optimale (OCT), ce qui, nous l’avons montré, interfère avec les essais de normalisation des données et la quantification des sphingolipides par chromatographie liquide spectrométrie de masse en tandem par électropulvérisation (LC-ESI-MS/MS)11 . Il a également été démontré que l’alcool polyvinylique et le polyéthylèneglycol, les principaux composants du composé OCT, entraînent la suppression des ions dans d’autres plates-formes d’analyse MS12,13,14,15. Par conséquent, le composé OCT doit être retiré des tissus avant l’analyse sphingolipidomique par MS.
Dans un rapport précédent, nous avons validé un protocole pour le retrait du composé OCT des échantillons humains pour l’analyse LC-ESI-MS/MS11 et la méthodologie utilisée pour peser les tissus pour la normalisation des données11. Ici, nous détaillons les étapes du protocole d’élimination des composés OCT sphingolilipidomique (sOCTrP) et montrons des données représentatives des tumeurs de l’adénocarcinome pulmonaire humain et des tissus adjacents normaux non impliqués.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’OCT est un agent de cryoconservation à long terme couramment utilisé dans les dépôts biologiques. Cependant, la TCO peut entraîner la suppression des ions lorsque les tissus sont analysés par diverses plates-formes de spectrométrie de masse12,13,14,15, ou entraîner une perte de signal lorsque les échantillons sont analysés par LC-ESI-MS/MS 11. La TCO dans l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les services et le soutien du projet de recherche ont été fournis par le VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core et le VCU Lipidomics and Metabolomics Core, qui sont financés en partie par le NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Ce travail a été soutenu par les subventions R21CA232234 des National Institutes of Health (Santiago Lima).
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
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