Summary

Подготовка тканей человека, встроенных в оптимальное компаундирование температуры резания для масс-спектрометрического анализа

Published: April 27, 2021
doi:

Summary

Сфинголипиды являются биологически активными метаболитами с хорошо известной ролью в заболеваниях человека. Характеристика изменений в тканях с помощью масс-спектрометрии может выявить роли в этиологии заболевания или определить терапевтические мишени. Однако OCT-соединение, используемое для криоконсервации в биорепозиториях, мешает масс-спектрометрии. Описаны методы анализа сфинголипидов в тканях человека, встроенных в ОКТ с помощью LC-ESI-MS/MS.

Abstract

Сфинголипиды являются клеточными компонентами, которые имеют хорошо установленную роль в метаболизме и болезнях человека. Масс-спектрометрия может быть использована для определения того, изменяются ли сфинголипиды при заболевании, и для изучения того, могут ли сфинголипиды быть клинически нацелены. Тем не менее, надлежащим образом подготовленные проспективные исследования, которые приобретают ткани непосредственно из хирургического набора, могут быть трудоемкими и технически, логистически и административно сложными. Напротив, ретроспективные исследования могут использовать криоконсервированные человеческие образцы, уже доступные, обычно в больших количествах, в тканевых биорепозиториях. Другие преимущества получения тканей из биорепозиториев включают доступ к информации, связанной с образцами тканей, включая гистологию, патологию и в некоторых случаях клинико-патологические переменные, все из которых могут быть использованы для изучения корреляций с данными липидомики. Однако технические ограничения, связанные с несовместимостью оптимальной температуры резания соединения (ОКТ), используемого в криоконсервации и масс-спектрометрии, являются техническим барьером для анализа липидов. Тем не менее, ранее мы показали, что OCT может быть легко удален из образцов биорепозиториев человека посредством циклов промывки и центрифугирования без изменения их содержания сфинголипидов. Мы также ранее установили, что сфинголипиды в тканях человека, криоконсервированные в ОКТ, стабильны до 16 лет. В этом отчете мы описываем этапы и рабочий процесс анализа сфинголипидов в образцах тканей человека, которые встроены в OCT, включая промывку тканей, взвешивание тканей для нормализации данных, извлечение липидов, подготовку образцов для анализа с помощью жидкостной хроматографии электрораспылительной ионизационной тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS / MS), интеграцию данных масс-спектрометрии, нормализацию данных и анализ данных.

Introduction

Сфинголипиды являются биологически активными метаболитами, известными своей ролью в метаболизме человека и заболеваниях 1,2. Они регулируют сложные клеточные процессы, такие как миграция клеток, выживание и гибель клеток, движение клеток, везикулярный трафик, клеточная инвазия и метастазирование, ангиогенез и производство цитокинов 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Дефекты в регуляции метаболизма сфинголипидов способствуют инициации и прогрессированию рака, определяют, насколько агрессивны раковые заболевания, и как рак реагирует и развивает устойчивость к терапии 3,10. Поэтому из-за этих широких воздействий на этиологию заболевания аналитические методы, которые могут точно установить специфические для заболевания изменения сфинголипидов, являются важными инструментами. Масс-спектрометрия (МС) является наиболее точным и надежным методом анализа изменений сфинголипидов.

Человеческие образцы, которые могут быть использованы для анализа сфинголипидных изменений, могут быть получены перспективно из хирургического набора или ретроспективно из тканевых биорепозиториев. Свежие ткани от операции выгодны, потому что они могут быть непосредственно проанализированы РС или другими аналитическими методами. Тем не менее, приобретение тканей в перспективе имеет административные, технические и логистические препятствия, и сбор достаточного количества образцов для достижения статистической мощности может быть сложной задачей. Получение тканей из биорепозиториев выгодно, потому что они могут быть приобретены ретроспективно, в большом количестве, а биорепозитории подтверждают гистологию и патологию, используют стандартные операционные процедуры для криогенного сохранения и хранения тканей и могут предоставлять клинико-патологические данные, которые могут быть использованы для корреляционного анализа. Однако для сохранения молекулярных и структурных особенностей биорепозитории могут криоконсервировать ткани, встраивая их в соединение оптимальной температуры резания (ОКТ), которое, как мы показали, мешает анализам нормализации данных и количественному определению сфинголипидов с помощью жидкостной хроматографии электрораспылительной ионизационной тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS)11 . Также было показано, что поливиниловый спирт и полиэтиленгликоль, первичные компоненты в соединении OCT, приводят к подавлению ионов в других платформах анализаMS 12,13,14,15. Поэтому соединение OCT должно быть удалено из тканей перед сфинголипидомическим анализом РС.

В предыдущем отчете мы подтвердили протокол удаления соединения OCT из образцов человека для анализа LC-ESI-MS/MS11 и методологию, используемую для взвешивания тканей для нормализации данных11. Здесь мы подробно описываем этапы протокола удаления соединений sphingolipidomic OCT (sOCTrP) и показываем репрезентативные данные опухолей аденокарциномы легких человека и нормальных прилегающих невовлеченных тканей.

Protocol

Деидентифицированные легочные ткани человека были получены из Университета Содружества Вирджинии (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core в соответствии с протоколом (#HM2471), утвержденным внутренним наблюдательным советом (IRB). Использование мышей для исследования и сбора тканей мышей было одобре?…

Representative Results

В этом протоколе мы подробно описываем метод удаления ОКТ из крио-сохраненных тканей человека и взвешиваем ткани для анализа LC-ESI-MS/MS. Материалы, необходимые для этой процедуры, перечислены в Таблице материалов. На рисунке 1 показаны результаты типичного экспер?…

Discussion

ОКТ является распространенным долгосрочным криосохраняющим агентом, используемым в биорепозиториях. Однако ОКТ может привести к подавлению ионов, когда ткани анализируются различными масс-спектрометрическими платформами 12,13,14,15, ил?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Услуги и поддержка исследовательского проекта были предоставлены VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core и VCU Lipidomics and Metabolomics Core, которые частично поддерживаются финансированием nih-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Эта работа была поддержана Национальными институтами грантов здравоохранения R21CA232234 (Сантьяго Лима).

Materials

1 mL polypropylene pipette tips NA NA Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes NA NA
10 mL Erlenmeyer flask VWR 89091-116 Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2 Sciex NA Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate Fisher Scientific A11550 For LC mobile phases
Analytical scale NA NA Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser Sartorius LH-723071 Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine Avanti Polar Lipids LM2212 Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine Avanti Polar Lipids LM2511 Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene Avanti Polar Lipids LM2512 Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine Avanti Polar Lipids LM2312 Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L VWR EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids Thermo Scientific 75007309 To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt Decon Labs 4101 Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven Shimadzu NA For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol Avanti Polar Lipids LM2000 Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate Avanti Polar Lipids LM2144 Internal standard
DGU20A5R degasser Shimadzu NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm VWR 53283-800 13×100 mm screw top tubes
Heated water bath NA NA For overnight lipid extraction
Homogenizer 150 Fisher Scientific 15-340-167 triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe Fisher Scientific 15-340-177 for homogenization
Kimwipes Kimtech 34120 Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L VWR EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system Shimadzu NA For LC-MS
Permanent marker VWR 52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) VWR 89001-502 13×100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline Thermo Scientific 10010023 To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette Eppendorf 4987000118 To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone VWR 89239-020 Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch VWR 46610-724 Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector Shimadzu NA
SpeedVac Thermo Scientific SPD2030P1220 For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column Sigma Aldrich 53822-U For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System Sciex NA For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath Branson Model 2800 for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer NA NA For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass VWR 47729572 13×100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS VWR BDH83645.400

References

  1. Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
  2. Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
  3. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
  4. Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
  5. Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
  6. Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
  7. Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
  8. Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
  9. Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
  10. Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. . Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).
  11. Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
  12. Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
  13. Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
  14. Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
  15. Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
check_url/fr/62552?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Boyd, A. E., Allegood, J., Lima, S. Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (170), e62552, doi:10.3791/62552 (2021).

View Video