Preparación de tejidos humanos incrustados en un compuesto de temperatura de corte óptima para el análisis de espectrometría de masas
Summary
Los esfingolípidos son metabolitos bioactivos con funciones bien establecidas en la enfermedad humana. La caracterización de alteraciones en tejidos con espectrometría de masas puede revelar roles en la etiología de la enfermedad o identificar objetivos terapéuticos. Sin embargo, el compuesto OCT utilizado para la criopreservación en biorepositorios interfiere con la espectrometría de masas. Describimos métodos para analizar esfingolípidos en tejidos humanos incrustados en OCT con LC-ESI-MS / MS.
Abstract
Los esfingolípidos son componentes celulares que tienen funciones bien establecidas en el metabolismo humano y la enfermedad. La espectrometría de masas se puede utilizar para determinar si los esfingolípidos están alterados en una enfermedad e investigar si los esfingolípidos pueden ser dirigidos clínicamente. Sin embargo, los estudios prospectivos con la potencia adecuada que adquieren tejidos directamente de la sala quirúrgica pueden llevar mucho tiempo y ser un desafío técnico, logístico y administrativo. En contraste, los estudios retrospectivos pueden aprovechar los especímenes humanos criopreservados ya disponibles, generalmente en grandes cantidades, en biorepositorios de tejidos. Otras ventajas de obtener tejidos de biorepositorios incluyen el acceso a la información asociada con las muestras de tejido, incluida la histología, la patología y, en algunos casos, las variables clínico-patológicas, todas las cuales se pueden utilizar para examinar las correlaciones con los datos lipidómicos. Sin embargo, las limitaciones técnicas relacionadas con la incompatibilidad del compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) utilizado en la criopreservación y espectrometría de masas es una barrera técnica para el análisis de lípidos. Sin embargo, hemos demostrado previamente que la OCT se puede eliminar fácilmente de muestras de biorepositorios humanos a través de ciclos de lavados y centrifugación sin alterar su contenido de esfingolípidos. También hemos establecido previamente que los esfingolípidos en tejidos humanos criopreservados en OCT son estables hasta por 16 años. En este informe, describimos los pasos y el flujo de trabajo para analizar esfingolípidos en muestras de tejido humano que están incrustadas en OCT, incluido el lavado de tejidos, el pesaje de tejidos para la normalización de datos, la extracción de lípidos, la preparación de muestras para su análisis por cromatografía líquida por electronización por electrospray, espectrometría de masas en tándem (LC-ESI-MS / MS), integración de datos de espectrometría de masas, normalización de datos y análisis de datos.
Introduction
Los esfingolípidos son metabolitos bioactivos conocidos por su papel en el metabolismo humano y la enfermedad 1,2. Regulan procesos celulares complejos como la migración celular, la supervivencia y muerte celular, el movimiento celular, el tráfico vesicular, la invasión celular y la metástasis, la angiogénesis y la producción de citoquinas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Los defectos en la regulación del metabolismo de los esfingolípidos contribuyen a la iniciación y progresión de los cánceres, determinan cuán agresivos son los cánceres y cómo los cánceres responden y desarrollan resistencia a la terapia 3,10. Por lo tanto, debido a estos amplios impactos en la etiología de la enfermedad, los métodos analíticos que pueden establecer con precisión las alteraciones de los esfingolípidos específicos de la enfermedad son herramientas importantes. La espectrometría de masas (EM) es el método más preciso y fiable para analizar las alteraciones de los esfingolípidos.
Las muestras humanas que se pueden utilizar para el análisis de alteraciones de esfingolípidos se pueden obtener prospectivamente de la sala quirúrgica o retrospectivamente de biorepositorios de tejidos. Los tejidos frescos de la cirugía son ventajosos porque pueden ser analizados directamente por EM u otros métodos analíticos. Sin embargo, la adquisición prospectiva de tejidos tiene obstáculos administrativos, técnicos y logísticos, y recolectar suficientes especímenes para alcanzar el poder estadístico puede ser un desafío. La obtención de tejidos de biorepositorios es ventajosa porque pueden adquirirse retrospectivamente, en grandes cantidades, y los biorepositorios confirman la histología y la patología, utilizan procedimientos operativos estándar para preservar y almacenar tejidos criogénicamente y pueden proporcionar datos clínicopatológicos que pueden usarse para análisis de correlación. Sin embargo, para preservar las características moleculares y estructurales, los biorepositorios pueden criopreservar tejidos incrustándolos en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), que hemos demostrado que interfiere con los ensayos de normalización de datos y la cuantificación de esfingolípidos por cromatografía líquida por electronización por electrospray espectrometría de masas en tándem (LC-ESI-MS / MS)11 . También se ha demostrado que el alcohol polivinílico y el polietilenglicol, los componentes principales del compuesto OCT, dan lugar a la supresión de iones en otras plataformas de análisis de EM12,13,14,15. Por lo tanto, el compuesto OCT debe eliminarse de los tejidos antes del análisis esfingolipidómico por SM.
En un informe anterior, hemos validado un protocolo para la eliminación de compuestos OCT de muestras humanas para el análisis LC-ESI-MS/MS11 y la metodología utilizada para el pesaje de tejidos para la normalización de datos11. Aquí, detallamos los pasos del protocolo de eliminación de compuestos de OCT esfingolipidómica (sOCTrP) y mostramos datos representativos de tumores de adenocarcinoma de pulmón humano y tejidos normales adyacentes no comprometidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La OCT es un agente de criopreservación común a largo plazo utilizado en biorepositorios. Sin embargo, la OCT puede resultar en supresión iónica cuando los tejidos son analizados por varias plataformas de espectrometría de masas12,13,14,15, o resultar en pérdida de señal cuando las muestras son analizadas por LC-ESI-MS/MS 11. La OCT en tejidos criopreservados tamb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los servicios y el apoyo del proyecto de investigación fueron proporcionados por el Núcleo de Adquisición y Análisis de Tejidos y Datos del Centro de Cáncer Masey de VCU y el Núcleo de Lipidómica y Metabolómica de VCU, que son apoyados en parte con fondos de la Subvención de Apoyo al Centro de Cáncer P30CA016059 del NIH-NCI. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones R21CA232234 (Santiago Lima).
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
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