Kütle Spektrometrisi Analizi için Optimum Kesme Sıcaklığı Bileşiğine Gömülü İnsan Dokularının Hazırlanması
Summary
Sfengolipidler, insan hastalıklarında iyi bilinen rollere sahip biyoaktif metabolitlerdir. Kütle spektrometresi ile dokulardaki değişikliklerin karakterize edilmesi, hastalık etiyolojisindeki rolleri ortaya çıkarabilir veya terapötik hedefleri tanımlayabilir. Bununla birlikte, biyodepolarda kriyoprezervasyon için kullanılan OCT bileşiği, kütle spektrometrisine müdahale eder. OCT’ye gömülü insan dokularındaki sfingolipidleri LC-ESI-MS / MS ile analiz etme yöntemlerini özetliyoruz.
Abstract
Sfengolipidler, insan metabolizmasında ve hastalığında iyi bilinen rollere sahip hücresel bileşenlerdir. Kütle spektrometrisi, sfingolipidlerin bir hastalıkta değişip değişmediğini belirlemek ve sfingolipidlerin klinik olarak hedeflenip hedeflenemeyeceğini araştırmak için kullanılabilir. Bununla birlikte, dokuları doğrudan cerrahi süitten alan uygun şekilde güçlendirilmiş prospektif çalışmalar zaman alıcı ve teknik, lojistik ve idari olarak zor olabilir. Buna karşılık, retrospektif çalışmalar, doku biyodepolarında genellikle çok sayıda bulunan kriyokorunmuş insan örneklerinden yararlanabilir. Dokuları biyodepolardan temin etmenin diğer avantajları, histoloji, patoloji ve bazı durumlarda klinikopatolojik değişkenler de dahil olmak üzere doku örnekleriyle ilişkili bilgilere erişimi içerir ve bunların hepsi lipidomik verilerle korelasyonları incelemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyonda ve kütle spektrometrisinde kullanılan optimal kesme sıcaklığı bileşiğinin (OCT) uyumsuzluğu ile ilgili teknik sınırlamalar, lipitlerin analizi için teknik bir engeldir. Bununla birlikte, OCT’nin, sfengolipid içeriğini değiştirmeden yıkama ve santrifüjleme döngüleri yoluyla insan biyodepo örneklerinden kolayca çıkarılabileceğini daha önce göstermiştik. Ayrıca, OKT’de kriyokorunmuş insan dokularındaki sfingolipidlerin 16 yıla kadar stabil olduğunu daha önce tespit etmiştik. Bu raporda, OCT’ye gömülü insan dokusu örneklerinde sfingolipidleri analiz etmek için kullanılan adımları ve iş akışını, yıkama dokuları, veri normalizasyonu için dokuların tartılması, lipitlerin ekstraksiyonu, sıvı kromatografisi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometrisi (LC-ESI-MS / MS), kütle spektrometrisi veri entegrasyonu, veri normalizasyonu ve veri analizi ile analiz için numunelerin hazırlanması dahil olmak üzere özetlemekteyiz.
Introduction
Sfengolipidler, insan metabolizması ve hastalığındaki rolleri ile bilinen biyoaktif metabolitlerdir 1,2. Hücre göçü, hücre sağkalımı ve ölümü, hücre hareketi, veziküler kaçakçılık, hücresel invazyon ve metastaz, anjiyogenez ve sitokinlerin üretimi gibi karmaşık hücresel süreçleri düzenlerler 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Sfengolipid metabolizmasının düzenlenmesindeki kusurlar, kanserlerin başlamasına ve ilerlemesine katkıda bulunur, kanserlerin ne kadar agresif olduğunu ve kanserlerin tedaviye nasıl tepki verdiğini ve direnç geliştirdiğini belirler 3,10. Bu nedenle, hastalığın etiyolojisi üzerindeki bu geniş etkileri nedeniyle, hastalığa özgü sfengolipid değişikliklerini kesin olarak belirleyebilen analitik yöntemler önemli araçlardır. Kütle spektrometresi (MS), sfengolipid değişikliklerini analiz etmek için en doğru ve güvenilir yöntemdir.
Sfengolipid değişikliklerinin analizi için kullanılabilecek insan örnekleri, cerrahi süitten prospektif olarak veya doku biyodepolarından retrospektif olarak elde edilebilir. Ameliyattan elde edilen taze dokular avantajlıdır çünkü MS veya diğer analitik yöntemlerle doğrudan analiz edilebilirler. Bununla birlikte, dokuların prospektif olarak elde edilmesinin idari, teknik ve lojistik engelleri vardır ve istatistiksel güce ulaşmak için yeterli örnek toplamak zor olabilir. Dokuların biyodepolardan elde edilmesi avantajlıdır, çünkü retrospektif olarak, çok sayıda edinilebilirler ve biyodepolar histoloji ve patolojiyi doğrular, dokuları kriyojenik olarak korumak ve depolamak için standart çalışma prosedürleri kullanır ve korelasyon analizleri için kullanılabilecek klinikopatolojik veriler sağlayabilir. Bununla birlikte, moleküler ve yapısal özellikleri korumak için, biyodepolar dokuları optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömerek kriyoprotektiflik edebilir, ki bu da veri normalleştirme tahlillerine ve sıvı kromatografisi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometrisi (LC-ESI-MS / MS) 11 ile sfengolipidlerin nicelleştirilmesine müdahale ettiğini gösterdik. . OCT bileşiğindeki birincil bileşenler olan polivinil alkol ve polietilen glikolün, diğer MS analiz platformlarında iyon baskılanmasına neden olduğu da gösterilmiştir12,13,14,15. Bu nedenle, OCT bileşiği MS tarafından sfengolipidomik analizden önce dokulardan uzaklaştırılmalıdır.
Önceki bir raporda, LC-ESI-MS/MS analizi11 için OCT bileşiğinin insan örneklerinden çıkarılmasına yönelik bir protokolü ve veri normalizasyonu için dokuları tartmak için kullanılan metodolojiyi11 olarak doğrulamıştık. Burada, sfengolipidomik OCT bileşiği çıkarma protokolünün (sOCTrP) adımlarını detaylandırıyoruz ve insan akciğer adenokarsinom tümörlerinden ve normal bitişik tutulmamış dokulardan temsili veriler gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
OKT, biyodepolarda kullanılan yaygın bir uzun süreli kriyo-koruma ajanıdır. Bununla birlikte, dokular çeşitli kütle spektrometresi platformları12,13,14,15 tarafından analiz edildiğinde OCT, iyon baskılanmasına neden olabilir veya numuneler LC-ESI-MS / MS11 tarafından analiz edildiğinde sinyal kaybına neden olabilir. Kriyokorunmuş dokulardaki OCT, Bradfor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma projesinin hizmetleri ve desteği, kısmen NIH-NCI Kanser Merkezi Destek Hibe P30CA016059’un finansmanıyla desteklenen VCU Massey Kanser Merkezi Doku ve Veri Toplama ve Analiz Çekirdeği ve VCU Lipidomik ve Metabolomik Çekirdeği tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibeleri Enstitüleri R21CA232234 (Santiago Lima) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. . Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
