يستخدم هذا الفحص الخلايا الجذعية الجنينية للفأر المتمايزة إلى أجسام جنينية مستزرعة في هلام الكولاجين 3D لتحليل العمليات البيولوجية التي تتحكم في تكوين الأوعية الدموية في المختبر. يمكن تطبيق هذه التقنية لاختبار الأدوية ، ونمذجة الأمراض ، ودراسة جينات معينة في سياق عمليات الحذف القاتلة من الناحية الجنينية.
تمكن التطورات الحديثة في الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) وتقنيات تحرير الجينات من تطوير نماذج جديدة للأمراض القائمة على الخلايا البشرية لبرامج اكتشاف الأدوية المظهرية (PDD). على الرغم من أن هذه الأجهزة الجديدة يمكن أن تتنبأ بسلامة وفعالية الأدوية التجريبية في البشر بشكل أكثر دقة ، إلا أن تطويرها إلى العيادة لا يزال يعتمد بشدة على بيانات الثدييات ، ولا سيما استخدام نماذج أمراض الفئران. بالتوازي مع نماذج الأمراض العضوية البشرية أو الأعضاء على الرقاقة ، فإن تطوير نماذج الفئران ذات الصلة في المختبر هو بالتالي حاجة غير ملباة لتقييم فعالية الدواء المباشر ومقارنات السلامة بين الأنواع وفي الجسم الحي وفي الظروف المختبرية . هنا ، يتم وصف مقايسة تنبت الأوعية الدموية التي تستخدم الخلايا الجذعية الجنينية للفأر المتمايزة إلى أجسام جنينية (EBs). EBs الوعائية المزروعة على هلام الكولاجين 3D تطوير الأوعية الدموية الجديدة التي تتوسع ، وهي عملية تسمى تنبت تولد الأوعية. يلخص هذا النموذج السمات الرئيسية لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي – تكوين الأوعية الدموية من شبكة الأوعية الدموية الموجودة مسبقا – بما في ذلك اختيار خلايا الطرف البطاني ، وهجرة الخلايا البطانية وتكاثرها ، وتوجيه الخلايا ، وتكوين الأنبوب ، وتجنيد الخلايا الجدارية. إنه قابل لفحص الأدوية والجينات التي تعدل تكوين الأوعية ويظهر أوجه التشابه مع فحوصات الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد (3D) الموصوفة مؤخرا بناء على تقنيات iPSC البشرية.
في العقود الثلاثة الماضية ، تم استخدام اكتشاف الأدوية القائم على الهدف (TDD) على نطاق واسع في اكتشاف الأدوية من قبل صناعة الأدوية. يتضمن TDD هدفا جزيئيا محددا يلعب دورا مهما في المرض ويعتمد على تطوير أنظمة زراعة الخلايا البسيطة نسبيا والقراءات لفحص الأدوية1. تتضمن معظم نماذج الأمراض النموذجية المستخدمة في برامج TDD طرق زراعة الخلايا التقليدية مثل الخلايا السرطانية أو خطوط الخلايا الخالدة المزروعة داخل بيئات اصطناعية وركائز غير فسيولوجية. وعلى الرغم من أن العديد من هذه النماذج قد وفر أدوات ناجعة لتحديد الأدوية المرشحة الناجحة، فإن استخدام مثل هذه النظم يمكن أن يكون موضع شك بسبب ضعف أهميتها المرضية2.
بالنسبة لمعظم الأمراض ، تكون الآليات الأساسية معقدة بالفعل وغالبا ما توجد أنواع مختلفة من الخلايا ومسارات إشارات مستقلة ومجموعات متعددة من الجينات تساهم في النمط الظاهري لمرض معين. وينطبق هذا أيضا على الأمراض الوراثية حيث يكون السبب الرئيسي هو طفرة في جين واحد. مع ظهور تقنيات الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) التي يسببها الإنسان وأدوات تحرير الجينات مؤخرا ، أصبح من الممكن الآن إنشاء عضويات ثلاثية الأبعاد ونماذج مرض عضو على رقاقة يمكن أن تلخص بشكل أفضل التعقيد البشري في الجسم الحي 3,4. يرتبط تطوير مثل هذه التقنيات بعودة الاهتمام ببرامج اكتشاف الأدوية ذات النمط الظاهري(PDD) 1. يمكن مقارنة PDD بالفحص التجريبي ، لأنها لا تعتمد على معرفة هوية هدف دواء معين أو فرضية حول دوره في المرض. ومن المسلم به الآن بشكل متزايد أن نهج PDD يساهم بقوة في اكتشاف الأدوية الأولى في فئتها5. نظرا لأن تطوير التقنيات العضوية البشرية والأعضاء على الرقاقة لا يزال في مهده ، فمن المتوقع أن توفر نماذج iPSC (المكملة بأدوات التصوير والتعلم الآليالمبتكرة 6,7) ، في المستقبل القريب ، نماذج جديدة متعددة للأمراض المعقدة القائمة على الخلايا لفحص الأدوية وبرامج PDD المرتبطة للتغلب على الإنتاجية الضعيفة لنهج TDD 8 ، 9.
في حين أن النماذج العضوية البشرية والأعضاء على الرقاقة يمكن أن توفر رؤى مهمة حول تعقيد المرض وتحديد الأدوية الجديدة ، فإن إدخال الأدوية في الممارسة السريرية الجديدة يعتمد أيضا بشدة على البيانات من النماذج الحيوانية لتقييم فعاليتها وسلامتها. من بينها ، الفئران المعدلة وراثيا هي بالتأكيد نماذج الثدييات الأكثر تفضيلا. لديهم العديد من المزايا لأن لديهم وقت جيل قصير نسبيا للثدييات ، ولديهم العديد من الأنماط الظاهرية المماثلة للأمراض البشرية ، ويمكن التلاعب بها وراثيا بسهولة. لذلك يتم استخدامها على نطاق واسع في برامج اكتشاف الأدوية10. ومع ذلك ، لا يزال سد الفجوة بين الفئران والبشر يمثل تحديا مهما11. إن تطوير نماذج الفئران في المختبر المكافئة للنماذج العضوية البشرية والأعضاء على الرقاقة يمكن أن يملأ هذه الفجوة جزئيا على الأقل لأنه سيسمح بإجراء مقارنات مباشرة بين فعالية الأدوية وسلامتها بين البيانات البشرية في الجسم الحي والبيانات البشرية في المختبر.
هنا ، يتم وصف مقايسة تنبت الأوعية الدموية في الأجسام الجنينية للفأر (EBs). تتكون الأوعية الدموية من الخلايا البطانية (البطانة الداخلية لجدران الأوعية) ، والخلايا الجدارية (خلايا العضلات الملساء الوعائية والخلايا المحيطة)12. يعتمد هذا البروتوكول على تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESCs) إلى EBs الوعائية باستخدام قطرات معلقة تلخص تمايز الخلايا البطانية الجديدة وتمايز الخلايا الجدارية13,14. يمكن إنشاء ESCs الفئران بسهولة في الثقافة من اليوم المعزول 3.5 الكيسات الأريمية للفأر ذات الخلفيات الجينيةالمختلفة 15. كما أنها توفر إمكانيات للتحليل النسيلي ، وتتبع النسب ، ويمكن التلاعب بها وراثيا بسهولة لإنشاء نماذج المرض13,16.
نظرا لأن الأوعية الدموية تغذي جميع الأعضاء ، فليس من المستغرب أن ترتبط العديد من الأمراض إن لم يكن كلها بالتغيرات في الأوعية الدموية الدقيقة. في الحالات المرضية ، يمكن أن تتبنى الخلايا البطانية حالة نشطة أو يمكن أن تصبح مختلة وظيفيا مما يؤدي إلى موت الخلايا الجدارية أو الهجرة بعيدا عن الأوعية الدموية. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تكوين الأوعية الدموية المفرط أو في خلخل الأوعية الدموية ، ويمكن أن يؤدي إلى تدفق دم غير طبيعي وحاجز الأوعية الدموية المعيب مما يؤدي إلى تسرب الخلايا المناعية ، والتهاب12،17،18،19. وبالتالي ، فإن الأبحاث الخاصة بتطوير الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية عالية ، وقد تم بالفعل تحديد العديد من اللاعبين والمفاهيم الجزيئية للاستهداف العلاجي. في هذا السياق ، فإن البروتوكول الموصوف مناسب بشكل خاص لبناء نماذج الأمراض واختبار الأدوية لأنه يلخص السمات الرئيسية لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي ، بما في ذلك اختيار الطرف البطاني وخلايا الساق ، وهجرة الخلايا البطانية وانتشارها ، وتوجيه الخلايا البطانية ، وتشكيل الأنبوب ، وتجنيد الخلايا الجدارية. كما يظهر أوجه التشابه مع فحوصات الأوعية الدموية 3D الموصوفة مؤخرا بناء على تقنيات iPSC البشرية20.
يصف هذا البروتوكول مقايسة تنبت الأوعية الدموية غير المتحيزة والقوية والقابلة للتكرار القائمة على 3D EB والتي تكون قابلة لفحص الأدوية والجينات التي تعدل تكوين الأوعية. توفر هذه الطريقة مزايا على العديد من المقايسات ثنائية الأبعاد (2D) المستخدمة على نطاق واسع باستخدام ثقافات الخلايا البطاني?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال منح من Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501) ، Health Holland (LSHM19057-H040) ، برنامج الزملاء الرائد Marie Skłodowska-Curie COFUND ، ومن قبل جمعية Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |