Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.
Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) en genbewerkingstechnologieën maken de ontwikkeling mogelijk van nieuwe op menselijke cellen gebaseerde ziektemodellen voor fenotypische geneesmiddelenontdekking (PDD) -programma’s. Hoewel deze nieuwe apparaten de veiligheid en werkzaamheid van experimentele geneesmiddelen bij mensen nauwkeuriger konden voorspellen, is hun ontwikkeling naar de kliniek nog steeds sterk afhankelijk van zoogdiergegevens, met name het gebruik van muizenziektemodellen. Parallel aan humane organoïde of organ-on-chip ziektemodellen is de ontwikkeling van relevante in vitro muismodellen daarom een onvervulde behoefte aan het evalueren van directe geneesmiddeleneffectiviteit en veiligheidsvergelijkingen tussen soorten en in vivo en in vitro aandoeningen. Hier wordt een vasculaire kiemtest beschreven die gebruik maakt van embryonale stamcellen van muizen die zijn gedifferentieerd in embryoïde lichamen (EB’s). Gevasculariseerde EB’s gekweekt op 3D-collageengel ontwikkelen nieuwe bloedvaten die uitzetten, een proces dat kiemende angiogenese wordt genoemd. Dit model vat de belangrijkste kenmerken samen van in vivo ontkiemende angiogenese-vorming van bloedvaten uit een reeds bestaand vasculair netwerk – inclusief endotheelcelselectie, endotheelcelmigratie en proliferatie, celgeleiding, buisvorming en rekrutering van muurschilderingen. Het is vatbaar voor screening op geneesmiddelen en genen die angiogenese moduleren en vertoont overeenkomsten met recent beschreven driedimensionale (3D) vasculaire assays op basis van menselijke iPSC-technologieën.
In de afgelopen drie decennia is target-based drug discovery (TDD) op grote schaal gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen door de farmaceutische industrie. TDD bevat een gedefinieerd moleculair doelwit dat een belangrijke rol speelt in een ziekte en is gebaseerd op de ontwikkeling van relatief eenvoudige celkweeksystemen en uitlezingen voor geneesmiddelenscreening1. De meeste typische ziektemodellen die in TDD-programma’s worden gebruikt, omvatten traditionele celkweekmethoden zoals kankercellen of onsterfelijke cellijnen die zijn gekweekt in kunstmatige omgevingen en niet-fysiologische substraten. Hoewel veel van deze modellen levensvatbare hulpmiddelen hebben geboden voor het identificeren van succesvolle kandidaat-geneesmiddelen, kan het gebruik van dergelijke systemen twijfelachtig zijn vanwege hun slechte ziekterelevantie2.
Voor de meeste ziekten zijn de onderliggende mechanismen inderdaad complex en verschillende celtypen, onafhankelijke signaalroutes en meerdere sets genen blijken vaak bij te dragen aan een specifiek ziektefenotype. Dit geldt ook voor erfelijke ziekten waarbij de primaire oorzaak een mutatie in één enkel gen is. Met de recente komst van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologieën en genbewerkingstools, is het nu mogelijk om 3D-organoïden en organ-on-chip ziektemodellen te genereren die de in vivo menselijke complexiteit beter kunnen samenvatten 3,4. De ontwikkeling van dergelijke technologieën wordt geassocieerd met een heropleving van de interesse in fenotypische geneesmiddelenontdekking (PDD) -programma’s1. PDD kan worden vergeleken met empirische screening, omdat ze niet afhankelijk zijn van kennis van de identiteit van een specifiek geneesmiddeldoelwit of een hypothese over de rol ervan bij de ziekte. De PDD-aanpak wordt nu steeds meer erkend om sterk bij te dragen aan de ontdekking van eersteklas geneesmiddelen5. Omdat de ontwikkeling van menselijke organoïde en organ-on-chip-technologieën nog in de kinderschoenen staat, wordt verwacht dat iPSC-modellen (aangevuld met innovatieve beeldvormings- en machine-learningtools6,7) in de nabije toekomst meerdere nieuwe complexe celgebaseerde ziektemodellen voor geneesmiddelenscreening en bijbehorende PDD-programma’s zullen bieden om de slechte productiviteit van de TDD-benadering te overwinnen8, 9.
Hoewel menselijke organoïde- en organ-on-chip-modellen belangrijke inzichten kunnen bieden in de complexiteit van de ziekte en in de identificatie van nieuwe geneesmiddelen, is het brengen van geneesmiddelen in de nieuwe klinische praktijk ook sterk afhankelijk van gegevens uit diermodellen om hun werkzaamheid en veiligheid te beoordelen. Onder hen zijn genetisch gemodificeerde muizen zeker de meest geprefereerde zoogdiermodellen. Ze hebben veel voordelen omdat ze een relatief korte generatietijd hebben voor zoogdieren, veel vergelijkbare fenotypen hebben als menselijke ziekten en gemakkelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd. Ze worden daarom op grote schaal gebruikt in programma’s voor het ontdekken van geneesmiddelen10. Het overbruggen van de kloof tussen muizen en mensen blijft echter een belangrijke uitdaging11. De ontwikkeling van in vitro muismodellen die gelijkwaardig zijn aan humane organoïde en organ-on-chip-modellen zou deze leemte ten minste gedeeltelijk kunnen opvullen, omdat het directe vergelijkingen van de werkzaamheid en veiligheid van geneesmiddelen tussen in vivo muis- en in vitro menselijke gegevens mogelijk zal maken.
Hier wordt een vasculaire kiemtest in embryoïde lichamen van muizen (EB’s) beschreven. Bloedvaten zijn samengesteld uit endotheelcellen (binnenbekleding van vaatwanden), muurschilderingen (vasculaire gladde spiercellen en pericyten)12. Dit protocol is gebaseerd op de differentiatie van muizenembryonale stamcellen (mESCs) in gevasculariseerde EB’s met behulp van hangende druppels die de novo endotheelcel- en muurschilderceldifferentiatie recapituleren13,14. Muis-SER’s kunnen gemakkelijk in cultuur worden vastgesteld van geïsoleerde dag 3.5 muisblastocysten met verschillende genetische achtergronden15. Ze bieden ook mogelijkheden voor klonale analyse, afstammingstracering en kunnen gemakkelijk genetisch worden gemanipuleerd om ziektemodellente genereren 13,16.
Omdat bloedvaten alle organen voeden, is het niet verrassend dat veel ziekten, zo niet alle, geassocieerd zijn met veranderingen in de microvasculatuur. In pathologische omstandigheden kunnen endotheelcellen een geactiveerde toestand aannemen of disfunctioneel worden, wat resulteert in de dood van muurschilderingen of migratie weg van bloedvaten. Deze kunnen leiden tot overmatige angiogenese of tot bloedvaten, kunnen een abnormale bloedstroom en een defecte bloedvatbarrière veroorzaken, wat leidt tot extravasatie van immuuncellen en ontsteking12,17,18,19. Onderzoek voor de ontwikkeling van geneesmiddelen die bloedvaten moduleren is daarom hoog, en meerdere moleculaire spelers en concepten zijn al geïdentificeerd voor therapeutische targeting. In deze context is het beschreven protocol bijzonder geschikt voor het bouwen van ziektemodellen en voor het testen van geneesmiddelen, omdat het de belangrijkste kenmerken van in vivo kiemende angiogenese samenvat, waaronder endotheelpunt- en stengelcelselectie, endotheelcelmigratie en -proliferatie, endotheelcelbegeleiding, buisvorming en rekrutering van muurschilderingen. Het vertoont ook overeenkomsten met recent beschreven 3D vasculaire assays op basis van menselijke iPSC-technologieën20.
Dit protocol beschrijft een onbevooroordeelde, robuuste en reproduceerbare 3D EB-gebaseerde vasculaire kiemtest die vatbaar is voor screening op geneesmiddelen en genen die angiogenese moduleren. Deze methode biedt voordelen ten opzichte van veel veelgebruikte tweedimensionale (2D) assays met behulp van endotheelcelculturen zoals Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) om migratie te monitoren (laterale scratch assay of de Boyden chamber assay)22,23 of proliferatie (celnummer tellen, detectie van DNA-synthese<sup…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND en door de Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |