In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests
Summary
Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.
Abstract
Jüngste Fortschritte bei induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) und Geneditierungstechnologien ermöglichen die Entwicklung neuartiger menschlicher zellbasierter Krankheitsmodelle für phänotypische Wirkstoffforschungsprogramme (PDD). Obwohl diese neuartigen Geräte die Sicherheit und Wirksamkeit von Prüfpräparaten beim Menschen genauer vorhersagen könnten, stützt sich ihre Entwicklung bis zur klinischen Entwicklung immer noch stark auf Daten von Säugetieren, insbesondere auf die Verwendung von Mauskrankheitsmodellen. Parallel zu humanen Organoid- oder Organ-on-Chip-Krankheitsmodellen ist die Entwicklung relevanter In-vitro-Mausmodelle daher ein ungedeckter Bedarf für die Bewertung direkter Arzneimittelwirksamkeits- und Sicherheitsvergleiche zwischen Spezies und In-vivo- und In-vitro-Bedingungen. In dieser Arbeit wird ein vaskulärer Keimtest beschrieben, der embryonale Stammzellen der Maus verwendet, die in Embryoidkörper (EBs) differenziert sind. Vaskularisierte EBs, die auf 3D-Kollagengel kultiviert werden, entwickeln neue Blutgefäße, die sich ausdehnen, ein Prozess, der als Keimangiogenese bezeichnet wird. Dieses Modell rekapituliert die wichtigsten Merkmale der in vivo sprießenden Angiogenese – Bildung von Blutgefäßen aus einem bereits bestehenden vaskulären Netzwerk – einschließlich der Selektion von Endothelspitzenzellen, der Migration und Proliferation von Endothelzellen, der Zellführung, der Röhrenbildung und der Rekrutierung von Muralzellen. Es ist für das Screening auf Medikamente und Gene geeignet, die die Angiogenese modulieren, und zeigt Ähnlichkeiten mit kürzlich beschriebenen dreidimensionalen (3D) vaskulären Assays, die auf humanen iPSC-Technologien basieren.
Introduction
In den letzten drei Jahrzehnten wurde die zielgerichtete Wirkstoffforschung (TDD) von der pharmazeutischen Industrie in großem Umfang in der Arzneimittelforschung eingesetzt. TDD beinhaltet ein definiertes molekulares Ziel, das eine wichtige Rolle bei einer Krankheit spielt, und beruht auf der Entwicklung relativ einfacher Zellkultursysteme und Readouts für das Wirkstoff-Screening1. Zu den meisten typischen Krankheitsmodellen, die in TDD-Programmen verwendet werden, gehören traditionelle Zellkulturmethoden wie Krebszellen oder immortalisierte Zelllinien, die in künstlichen Umgebungen und unphysiologischen Substraten gezüchtet werden. Obwohl viele dieser Modelle praktikable Werkzeuge zur Identifizierung erfolgreicher Arzneimittelkandidaten zur Verfügung gestellt haben, kann der Einsatz solcher Systeme aufgrund ihrer geringen Krankheitsrelevanz fraglich sein2.
Bei den meisten Krankheiten sind die zugrunde liegenden Mechanismen in der Tat komplex und verschiedene Zelltypen, unabhängige Signalwege und mehrere Gensätze tragen oft zu einem bestimmten Krankheitsphänotyp bei. Dies gilt auch für Erbkrankheiten, bei denen die Hauptursache eine Mutation in einem einzigen Gen ist. Mit dem jüngsten Aufkommen von Technologien für humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) und Geneditierungswerkzeugen ist es nun möglich, 3D-Organoide und Organ-on-Chip-Krankheitsmodelle zu generieren, die die menschliche Komplexität in vivo besser rekapitulieren könnten 3,4. Die Entwicklung solcher Technologien ist mit einem Wiederaufleben des Interesses an phänotypischen Wirkstoffforschungsprogrammen (PDD) verbunden1. PDD kann mit empirischem Screening verglichen werden, da sie nicht auf dem Wissen über die Identität eines bestimmten Wirkstoffziels oder einer Hypothese über seine Rolle bei der Krankheit beruht. Der PDD-Ansatz wird heute zunehmend als wichtiger Beitrag zur Entdeckung von First-in-Class-Medikamenten anerkannt5. Da die Entwicklung menschlicher Organoid- und Organ-on-Chip-Technologien noch in den Kinderschuhen steckt, wird erwartet, dass iPSC-Modelle (ergänzt durch innovative Bildgebungs- und maschinelle Lernwerkzeuge 6,7) in naher Zukunft mehrere neuartige komplexe zellbasierte Krankheitsmodelle für das Wirkstoffscreening und die damit verbundenen PDD-Programme bereitstellen werden, um die geringe Produktivität des TDD-Ansatzes zu überwinden8. 9. Sonstiges
Während menschliche Organoid- und Organ-on-Chip-Modelle wichtige Einblicke in die Komplexität von Krankheiten und die Identifizierung neuer Medikamente liefern können, ist die Einführung von Medikamenten in die neue klinische Praxis auch stark auf Daten aus Tiermodellen angewiesen, um ihre Wirksamkeit und Sicherheit zu bewerten. Unter ihnen sind genetisch veränderte Mäuse sicherlich die am meisten bevorzugten Säugetiermodelle. Sie haben viele Vorteile, da sie eine relativ kurze Generationszeit für Säugetiere haben, viele ähnliche Phänotypen wie menschliche Krankheiten haben und leicht genetisch manipuliert werden können. Sie werden daher in großem Umfang in Arzneimittelforschungsprogrammen eingesetzt10. Die Überbrückung der Kluft zwischen Mäusen und Menschen bleibt jedoch eine wichtige Herausforderung11. Die Entwicklung von In-vitro-Mausmodellen, die humanen Organoid- und Organ-on-Chip-Modellen entsprechen, könnte diese Lücke zumindest teilweise schließen, da sie direkte Vergleiche der Wirksamkeit und Sicherheit von Medikamenten zwischen In-vivo-Maus– und In-vitro-Humandaten ermöglicht.
In dieser Arbeit wird ein vaskulärer Keimtest in Maus-Embryoidkörpern (EBs) beschrieben. Blutgefäße bestehen aus Endothelzellen (innere Auskleidung der Gefäßwände), Wandzellen (glatte Gefäßmuskelzellen und Perizyten)12. Dieses Protokoll basiert auf der Differenzierung von embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) der Maus in vaskularisierte EBs unter Verwendung von hängenden Tröpfchen, die die de novo Endothelzell- und Muralzelldifferenzierung rekapitulieren13,14. ES-Zellen der Maus können leicht in Kultur aus isolierten Tag-3.5-Blastozysten der Maus mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund etabliert werden15. Sie bieten auch Möglichkeiten für klonale Analysen, die Rückverfolgung von Abstammungslinien und können leicht genetisch manipuliert werden, um Krankheitsmodelle zu erstellen13,16.
Da Blutgefäße alle Organe ernähren, ist es nicht verwunderlich, dass viele, wenn nicht sogar alle, Krankheiten mit Veränderungen der Mikrogefäße verbunden sind. Unter pathologischen Zuständen können Endothelzellen einen aktivierten Zustand annehmen oder dysfunktional werden, was zum Absterben von Muralzellen oder zur Abwanderung von Blutgefäßen führt. Diese können zu einer übermäßigen Angiogenese oder zu einer Verdünnung der Gefäße führen, können einen abnormalen Blutfluss und eine defekte Blutgefäßbarriere induzieren, was zu einer Extravasation von Immunzellen und Entzündungen führt12,17,18,19. Die Forschung für die Entwicklung von Medikamenten, die Blutgefäße modulieren, ist daher hoch, und es wurden bereits mehrere molekulare Akteure und Konzepte für die therapeutische Ausrichtung identifiziert. In diesem Zusammenhang eignet sich das beschriebene Protokoll besonders für die Erstellung von Krankheitsmodellen und für die Erprobung von Medikamenten, da es die wichtigsten Merkmale der in vivo keimenden Angiogenese rekapituliert, einschließlich der Selektion von Endothelspitzen- und Stielzellen, der Migration und Proliferation von Endothelzellen, der Führung von Endothelzellen, der Röhrenbildung und der Rekrutierung von Muralzellen. Es zeigt auch Ähnlichkeiten mit kürzlich beschriebenen 3D-vaskulären Assays, die auf humanen iPSC-Technologien basieren20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen unvoreingenommenen, robusten und reproduzierbaren 3D-EB-basierten vaskulären Sprouting-Assay, der für das Screening auf Medikamente und Gene geeignet ist, die die Angiogenese modulieren. Diese Methode bietet Vorteile gegenüber vielen weit verbreiteten zweidimensionalen (2D) Assays, bei denen Endothelzellkulturen wie Human Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) zur Überwachung der Migration (Lateral Scratch Assay oder der Boyden-Kammer-Assay)22,23 oder der Proliferation (Zählen der Zella…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), des Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND und der Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO) unterstützt.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
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