इन विट्रो संवहनी रोग मॉडलिंग और दवा परीक्षण के लिए माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके एंजियोजेनेसिस की त्रि-आयामी अंकुरण परख
Summary
यह परख विट्रो में अंकुरित एंजियोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाली जैविक प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए 3 डी-कोलेजन जेल में संवर्धित भ्रूण निकायों में विभेदित माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करती है। तकनीक को दवाओं के परीक्षण, बीमारियों के मॉडलिंग और विलोपन के संदर्भ में विशिष्ट जीन ों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है जो भ्रूण रूप से घातक हैं।
Abstract
प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) और जीन संपादन प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति फेनोटाइपिक दवा खोज (पीडीडी) कार्यक्रमों के लिए नए मानव सेल-आधारित रोग मॉडल के विकास को सक्षम करती है। यद्यपि ये नए उपकरण मनुष्यों में जांच दवाओं की सुरक्षा और प्रभावकारिता की अधिक सटीक भविष्यवाणी कर सकते हैं, क्लिनिक में उनका विकास अभी भी स्तनधारी डेटा पर दृढ़ता से निर्भर करता है, विशेष रूप से माउस रोग मॉडल का उपयोग। मानव ऑर्गनॉइड या ऑर्गन-ऑन-चिप रोग मॉडल के समानांतर, प्रासंगिक इन विट्रो माउस मॉडल का विकास इसलिए प्रजातियों के बीच और विवो और इन विट्रो स्थितियों में प्रत्यक्ष दवा प्रभावकारिता और सुरक्षा तुलना के मूल्यांकन के लिए एक अपूर्ण आवश्यकता है। यहां, एक संवहनी अंकुरण परख जो भ्रूण के शरीर (ईबी) में विभेदित माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करती है, का वर्णन किया गया है। 3 डी-कोलेजन जेल पर संवर्धित संवहनी ईबी नई रक्त वाहिकाओं को विकसित करते हैं जो विस्तार करते हैं, एक प्रक्रिया जिसे अंकुरित एंजियोजेनेसिस कहा जाता है। यह मॉडल विवो स्प्राउटिंग एंजियोजेनेसिस की प्रमुख विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करता है- पहले से मौजूद संवहनी नेटवर्क से रक्त वाहिकाओं का गठन- जिसमें एंडोथेलियल टिप सेल चयन, एंडोथेलियल सेल माइग्रेशन और प्रसार, सेल मार्गदर्शन, ट्यूब गठन और भित्ति कोशिका भर्ती शामिल हैं। यह एंजियोजेनेसिस को संशोधित करने वाली दवाओं और जीन ों के लिए स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है और मानव आईपीएससी प्रौद्योगिकियों के आधार पर हाल ही में वर्णित त्रि-आयामी (3 डी) संवहनी परख के साथ समानताएं दिखाता है।
Introduction
पिछले तीन दशकों में, दवा उद्योग द्वारा दवा की खोज में लक्ष्य-आधारित दवा खोज (टीडीडी) को व्यापक रूप से नियोजित किया गया है। टीडीडी एक बीमारी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने वाले एक परिभाषित आणविक लक्ष्य को शामिल करता है और दवा स्क्रीनिंग1 के लिए अपेक्षाकृत सरल सेल कल्चर सिस्टम और रीडआउट के विकास पर निर्भर करता है। टीडीडी कार्यक्रमों में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश विशिष्ट रोग मॉडल में पारंपरिक सेल कल्चर विधियां शामिल हैं जैसे कि कैंसर कोशिकाएं या कृत्रिम वातावरण और गैर-शारीरिक सब्सट्रेट्स के भीतर उगाई गई अमर सेल लाइनें। यद्यपि इनमें से कई मॉडलों ने सफल दवा उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए व्यवहार्य उपकरण प्रदान किए हैं, लेकिन ऐसी प्रणालियों का उपयोग उनकी खराब बीमारी प्रासंगिकता के कारण संदिग्ध होसकता है।
अधिकांश बीमारियों के लिए, अंतर्निहित तंत्र वास्तव में जटिल होते हैं और विभिन्न सेल प्रकार, स्वतंत्र सिग्नलिंग मार्ग, और जीन के कई सेट अक्सर एक विशिष्ट रोग फेनोटाइप में योगदान करने के लिए पाए जाते हैं। यह विरासत में मिली बीमारियों के लिए भी सच है जहां प्राथमिक कारण एक एकल जीन में उत्परिवर्तन है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकियों और जीन संपादन उपकरणों के हालिया आगमन के साथ, अब 3 डी ऑर्गेनोइड्स और ऑर्गन-ऑन-चिप रोग मॉडल उत्पन्न करना संभव है जो विवो मानव जटिलता 3,4 में बेहतर सुधार कर सकते हैं। ऐसी प्रौद्योगिकियों का विकास फेनोटाइपिक दवा खोज (पीडीडी) कार्यक्रमों में रुचि में पुनरुत्थान के साथ जुड़ा हुआ है। पीडीडी की तुलना अनुभवजन्य स्क्रीनिंग से की जा सकती है, क्योंकि वे एक विशिष्ट दवा लक्ष्य की पहचान के ज्ञान या बीमारी में इसकी भूमिका के बारे में एक परिकल्पना पर भरोसा नहीं करते हैं। पीडीडी दृष्टिकोण अब पहली श्रेणीकी दवाओं की खोज में दृढ़ता से योगदान करने के लिए तेजी से मान्यता प्राप्त है। क्योंकि मानव ऑर्गनॉइड और ऑर्गन-ऑन-चिप प्रौद्योगिकियों का विकास अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है, यह उम्मीद की जाती है कि आईपीएससी मॉडल (अभिनव इमेजिंग और मशीन-लर्निंग टूल 6,7 के साथ पूरक) निकट भविष्य में, दवा स्क्रीनिंग के लिए कई नए जटिल सेल-आधारित रोग मॉडल और टीडीडीदृष्टिकोण 8 की खराब उत्पादकता को दूर करने के लिए संबंधित पीडीडी कार्यक्रम प्रदान करेंगे। 9.
जबकि मानव ऑर्गनॉइड और ऑर्गन-ऑन-चिप मॉडल रोग जटिलता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं और नई दवाओं की पहचान कर सकते हैं, दवाओं को नए नैदानिक अभ्यास में लाना भी उनकी प्रभावकारिता और सुरक्षा का आकलन करने के लिए पशु मॉडल के डेटा पर दृढ़ता से निर्भर करता है। उनमें से, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहे निश्चित रूप से सबसे पसंदीदा स्तनधारी मॉडल हैं। उनके पास कई फायदे हैं क्योंकि उनके पास स्तनधारियों के लिए अपेक्षाकृत कम पीढ़ी का समय है, मानव रोगों के समान कई फेनोटाइप हैं, और आसानी से आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है। इसलिए वे दवा खोज कार्यक्रमों10 में बड़े पैमाने पर उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, चूहों और मनुष्यों के बीच की खाई को पाटना एकमहत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है। मानव ऑर्गनॉइड और ऑर्गन-ऑन-चिप मॉडल के बराबर इन विट्रो माउस मॉडल का विकास कम से कम आंशिक रूप से इस अंतर को भर सकता है क्योंकि यह विवो माउस और इन विट्रो मानव डेटा के बीच प्रत्यक्ष दवा प्रभावकारिता और सुरक्षा तुलना की अनुमति देगा।
यहां, माउस भ्रूण निकायों (ईबी) में एक संवहनी अंकुरण परख का वर्णन किया गया है। रक्त वाहिकाएं एंडोथेलियल कोशिकाओं (पोत की दीवारों की आंतरिक परत), भित्ति कोशिकाओं (संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और पेरिसाइट) से बनी होती हैं। यह प्रोटोकॉल माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एमईएससी) को संवहनी ईबी में विभेदन पर आधारित है, जिसमें लटकती बूंदों का उपयोग किया जाता है जो डे नोवो एंडोथेलियल सेल और म्यूरल सेल भेदभाव13,14 को पुन: उत्पन्न करते हैं। माउस ईएससी को अलग-अलग दिन 3.5 माउस ब्लास्टोसिस्ट से संस्कृति में आसानी से स्थापित किया जा सकता है जिसमें अलग-अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि होतीहै। वे क्लोनल विश्लेषण, वंश अनुरेखण के लिए संभावनाएं भी प्रदान करते हैं, और रोग मॉडल13,16 उत्पन्न करने के लिए आसानी से आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है।
चूंकि रक्त वाहिकाएं सभी अंगों का पोषण करती हैं, इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि कई बीमारियां यदि सभी नहीं, तो माइक्रोवास्कुलचर में परिवर्तन से जुड़ी होती हैं। पैथोलॉजिकल स्थितियों में, एंडोथेलियल कोशिकाएं एक सक्रिय स्थिति को अपना सकती हैं या निष्क्रिय हो सकती हैं जिसके परिणामस्वरूप भित्ति कोशिका मृत्यु या रक्त वाहिकाओं से दूर प्रवास हो सकता है। इनके परिणामस्वरूप अत्यधिक एंजियोजेनेसिस या वाहिका दुर्लभता हो सकती है, असामान्य रक्त प्रवाह और दोषपूर्ण रक्त वाहिका बाधा को प्रेरित कर सकती है जिससे प्रतिरक्षा कोशिका बहिर्वाह और सूजन 12,17,18,19 हो सकती है। रक्त वाहिकाओं को संशोधित करने वाली दवाओं के विकास के लिए अनुसंधान, इसलिए उच्च है, और चिकित्सीय लक्ष्यीकरण के लिए कई आणविक खिलाड़ियों और अवधारणाओं की पहचान पहले से ही की जा चुकी है। इस संदर्भ में, वर्णित प्रोटोकॉल रोग मॉडल के निर्माण और दवा परीक्षण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है क्योंकि यह एंडोथेलियल टिप और डंठल सेल चयन, एंडोथेलियल सेल माइग्रेशन और प्रसार, एंडोथेलियल सेल मार्गदर्शन, ट्यूब गठन और भित्ति सेल भर्ती सहित विवो स्प्राउटिंग एंजियोजेनेसिस की प्रमुख विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करता है। यह मानव आईपीएससी प्रौद्योगिकियों20 के आधार पर हाल ही में वर्णित 3 डी संवहनी परख के साथ समानताएं भी दिखाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल एक निष्पक्ष, मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य 3 डी ईबी-आधारित संवहनी अंकुरण परख का वर्णन करता है जो एंजियोजेनेसिस को संशोधित करने वाली दवाओं और जीन ों के लिए स्क्रीनिंग के लिए उत्तर?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेडरलैंड्स ऑर्गनाइजेशन वूर गेज़ोन्डहाइडोंडरज़ोक एन ज़ोर्गिनोवटी (ज़ोनएमडब्ल्यू 446002501), हेल्थ हॉलैंड (एलएसएचएम 19057-एच040), लीडिंग फेलो प्रोग्राम मैरी स्क्लोडोवस्का-क्यूरी कॉफंड और एसोसिएशन मलाडी डी रेंडू-ओस्लर (एएमआरओ) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
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