インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ
Summary
このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in vitroで発芽血管新生を制御する生物学的プロセスを解析します。この技術は、薬物の検査、疾患のモデリング、および胚的に致命的な欠失の文脈での特定の遺伝子の研究に適用できます。
Abstract
人工多能性幹細胞(iPSC)および遺伝子編集技術の最近の進歩により、表現型創薬(PDD)プログラムのための新しいヒト細胞ベースの疾患モデルの開発が可能になりました。これらの新しいデバイスは、ヒトにおける治験薬の安全性と有効性をより正確に予測することができますが、臨床への開発は依然として哺乳類のデータ、特にマウス疾患モデルの使用に強く依存しています。したがって、ヒトオルガノイドまたは臓器オンチップ疾患モデルと並行して、関連するin vitroマウスモデルの開発は、種間およびin vivoおよびin vitro条件との間の直接的な薬効および安全性比較を評価するための満たされていないニーズです。 ここでは、胚様体(EB)に分化させたマウス胚性幹細胞を利用する血管発芽アッセイについて説明する。3Dコラーゲンゲル上で培養された血管新生EBは、発芽血管新生と呼ばれるプロセスである拡張する新しい血管を発達させます。このモデルは、内皮先端細胞の選択、内皮細胞の移動と増殖、細胞誘導、管形成、壁細胞動員など、既存の血管網からの血管の形成であるin vivo発芽血管新生の重要な特徴を要約しています。血管新生を調節する薬物や遺伝子のスクリーニングに適しており、最近記載されたヒトiPS細胞技術に基づく3次元(3D)血管アッセイとの類似性を示しています。
Introduction
過去30年間、ターゲットベースの創薬(TDD)は、製薬業界による創薬に広く採用されてきました。TDDは、疾患において重要な役割を果たす定義された分子標的を組み込んでおり、比較的単純な細胞培養システムの開発と薬物スクリーニングのための読み出しに依存しています1。TDDプログラムで使用される最も典型的な疾患モデルには、人工環境および非生理学的基質内で増殖した癌細胞または不死化細胞株などの従来の細胞培養方法が含まれる。これらのモデルの多くは、成功した薬剤候補を特定するための実行可能なツールを提供していますが、そのようなシステムの使用は、疾患との関連性が低いため、疑わしい場合があります2。
ほとんどの疾患では、根底にあるメカニズムは確かに複雑であり、さまざまな細胞型、独立したシグナル伝達経路、および複数の遺伝子セットが特定の疾患表現型に寄与することがしばしば見られます。これは、主な原因が1つの遺伝子の突然変異である遺伝性疾患にも当てはまります。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)技術と遺伝子編集ツールの最近の登場により、in vivoのヒトの複雑さをよりよく再現できる3Dオルガノイドと臓器チップ疾患モデルを生成できるようになりました3,4。このような技術の開発は、表現型創薬(PDD)プログラムへの関心の復活に関連しています1。PDDは、特定の薬物標的の同一性に関する知識や疾患におけるその役割に関する仮説に依存しないため、経験的スクリーニングと比較することができます。PDDアプローチは、ファーストインクラスの医薬品の発見に大きく貢献することがますます認識されています5。ヒトオルガノイドおよび臓器オンチップ技術の開発はまだ初期段階にあるため、iPS細胞モデル(革新的なイメージングおよび機械学習ツール6,7で補完)は、近い将来、TDDアプローチの生産性の低さを克服するための薬物スクリーニングおよび関連するPDDプログラムのための複数の新しい複雑な細胞ベースの疾患モデルを提供することが期待されています8。9.
ヒトオルガノイドおよび臓器オンチップモデルは、疾患の複雑さと新薬の同定に関する重要な洞察を提供することができますが、薬物を新しい臨床診療に持ち込むには、動物モデルからのデータにも大きく依存して、その有効性と安全性を評価します。その中で、遺伝子改変マウスは確かに最も好ましい哺乳類モデルである。哺乳類の世代時間が比較的短く、人間の病気と多くの表現型が類似しており、簡単に遺伝子操作できるため、多くの利点があります。したがって、それらは創薬プログラムで広く使用されています10。しかし、マウスとヒトの間のギャップを埋めることは、依然として重要な課題です11。ヒトオルガノイドおよび臓器オンチップモデルと同等のin vitroマウスモデルの開発は、in vivoマウスとin vitroヒトデータ間の直接的な薬効および安全性比較を可能にするため、このギャップを少なくとも部分的に埋めることができます。
ここでは、マウス胚様体(EB)における血管発芽アッセイについて説明する。血管は、内皮細胞(血管壁の内層)、壁細胞(血管平滑筋細胞および周皮細胞)で構成されています12。このプロトコルは、de novo内皮細胞および壁細胞の分化を再現するハンギング液滴を使用して、マウス胚性幹細胞(mESC)を血管化EBに分化することに基づいています13,14。マウスESCは、異なる遺伝的背景を有する単離された3.5日目のマウス胚盤胞からの培養において容易に確立することができる15。それらはまた、クローン分析、系統追跡の可能性を提供し、疾患モデルを生成するために容易に遺伝子操作することができる13,16。
血管はすべての臓器に栄養を与えるので、すべてではないにしても多くの病気が微小血管系の変化に関連していることは驚くべきことではありません。病理学的状態では、内皮細胞は活性化状態をとるか、機能不全になり、壁細胞の死または血管からの遊走を引き起こす可能性があります。これらは、過剰な血管新生または血管希薄化をもたらす可能性があり、免疫細胞血管外漏出、および炎症につながる異常な血流および血管バリアの欠陥を誘発し得る12、17、18、19。したがって、血管を調節する薬物の開発のための研究は高度であり、治療標的のための複数の分子プレーヤーおよび概念がすでに同定されている。これに関連して、記載されたプロトコルは、内皮先端および茎細胞の選択、内皮細胞の遊走および増殖、内皮細胞の誘導、チューブ形成、および壁細胞動員を含むin vivo発芽血管新生の重要な特徴を要約するため、疾患モデルの構築および薬物試験に特に適している。また、ヒトiPS細胞技術に基づく最近記載された3D血管アッセイとの類似性も示しています20。
Protocol
1. mESCの培地調製と培養 サプリメント1xグラスゴーMEM(G-MEM BHK-21)培地を使用して、10%(vol/vol)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、0.05 mM β-メルカプトエタノール、1x非必須アミノ酸(NEAA 1x)、2 mM L-グルタミン、および1 mMピルビン酸ナトリウムを含むサプリメント1xグラスゴーMEM(G-MEM BHK-21)培地を使用して、コンディショニング培地+/-(CM+/-)を準備します。 白血病抑制因子(LIF)(1,500 U/mL)および0.1 …
Representative Results
血管発芽アッセイのプロトコル概要を図1に示す。3つの独立した129/Ola mESC株(Z/Red、R1、およびE14)に由来する9日齢のEBを、コラゲナーゼAを用いて酵素的に単一細胞に解離させた。すべての細胞株が強固な内皮分化を示し、内皮細胞への分化能に差は認められなかった。全ての細胞株は、内皮細胞の約10.5%±1.3%を産生した(図2A)。PECAM-1(+)細胞集団におけ…
Discussion
このプロトコルは、血管新生を調節する薬物および遺伝子のスクリーニングに適した、偏りのない、堅牢で再現性のある3D EBベースの血管発芽アッセイについて説明しています。この方法は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)などの内皮細胞培養を使用して、遊走(ラテラルスクラッチアッセイまたはボイデンチャンバーアッセイ)22,23または増殖(細胞数のカウント、DNA合成の検出、増殖マー…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、オランダの組織団体(ZonMW 446002501)、Health Holland(LSHM19057-H040)、Leading Fellows Program Marie Skłodowska-Curie COFUND、およびMaladie de Rendu-Osler協会(AMRO)からの助成金によって支援されました。
Materials
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
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