JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Biologie

In vitro Tredimensionel spireanalyse af angiogenese ved hjælp af museembryonale stamceller til vaskulær sygdomsmodellering og lægemiddeltest

Published: May 11, 2021
doi:
10.3791/62554
, , ,
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology),Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris,INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

Summary

Dette assay anvender embryonale stamceller fra mus, der er differentieret i embryoide kroppe dyrket i 3D-kollagengel, til at analysere de biologiske processer, der styrer spirende angiogenese in vitro. Teknikken kan anvendes til test af lægemidler, modellering af sygdomme og til at studere specifikke gener i forbindelse med deletioner, der er embryonalt dødelige.

Abstract

Nylige fremskridt inden for inducerede pluripotente stamceller (iPSC) og genredigeringsteknologier muliggør udvikling af nye humane cellebaserede sygdomsmodeller til fænotypiske lægemiddelopdagelsesprogrammer (PDD). Selv om dette nye udstyr kunne forudsige forsøgslægemidlers sikkerhed og virkning hos mennesker mere præcist, er deres udvikling til klinikken stadig stærkt afhængig af pattedyrsdata, navnlig brugen af modeller for sygdomme hos mus. Parallelt med humane organoid- eller organ-on-chip-sygdomsmodeller er udviklingen af relevante in vitro-musemodeller derfor et uopfyldt behov for at evaluere direkte lægemiddeleffektivitets- og sikkerhedssammenligninger mellem arter og in vivo– og in vitro-tilstande. Her beskrives et vaskulært spiringsassay, der udnytter museembryonale stamceller differentieret til embryoidlegemer (EB’er). Vaskulariserede EB’er dyrket på 3D-kollagen gel udvikler nye blodkar, der udvides, en proces kaldet spirende angiogenese. Denne model rekapitulerer nøglefunktioner i in vivo spirende angiogenesedannelse af blodkar fra et allerede eksisterende vaskulært netværk – herunder valg af endotelspidscelle, endotelcellemigration og proliferation, cellevejledning, rørdannelse og rekruttering af vægmalericeller. Det er egnet til screening for lægemidler og gener, modulerende angiogenese og viser ligheder med nyligt beskrevne tredimensionelle (3D) vaskulære assays baseret på humane iPSC-teknologier.

Introduction

I de sidste tre årtier har målbaseret lægemiddelopdagelse (TDD) været bredt anvendt i lægemiddelopdagelse af medicinalindustrien. TDD inkorporerer et defineret molekylært mål, der spiller en vigtig rolle i en sygdom og er afhængig af udviklingen af relativt enkle cellekultursystemer og aflæsninger til lægemiddelscreening1. De fleste typiske sygdomsmodeller, der anvendes i TDD-programmer, omfatter traditionelle cellekulturmetoder såsom kræftceller eller udødeliggjorte cellelinjer dyrket i kunstige miljøer og ikke-fysiologiske substrater. Selv om mange af disse modeller har givet levedygtige værktøjer til at identificere vellykkede lægemiddelkandidater, kan brugen af sådanne systemer være tvivlsom på grund af deres ringe sygdomsrelevans2.

For de fleste sygdomme er de underliggende mekanismer faktisk komplekse, og forskellige celletyper, uafhængige signalveje og flere sæt gener viser sig ofte at bidrage til en bestemt sygdomsfænotype. Dette gælder også for arvelige sygdomme, hvor den primære årsag er en mutation i et enkelt gen. Med den nylige fremkomst af humant inducerede pluripotente stamcelleteknologier (iPSC) og genredigeringsværktøjer er det nu muligt at generere 3D-organoider og organ-on-chip-sygdomsmodeller, der bedre kan rekapitulere in vivo-menneskelig kompleksitet 3,4. Udviklingen af sådanne teknologier er forbundet med en genopblussen i interessen for fænotypiske lægemiddelopdagelsesprogrammer (PDD)1. PDD kan sammenlignes med empirisk screening, da de ikke er afhængige af viden om identiteten af et specifikt lægemiddelmål eller en hypotese om dets rolle i sygdom. PDD-tilgangen anerkendes nu i stigende grad for at bidrage stærkt til opdagelsen af førsteklasses lægemidler5. Da udviklingen af humane organoid- og organ-on-chip-teknologier stadig er i sin vorden, forventes det, at iPSC-modeller (suppleret med innovative billeddannelses- og maskinlæringsværktøjer 6,7) i den nærmeste fremtid vil tilvejebringe flere nye komplekse cellebaserede sygdomsmodeller til lægemiddelscreening og tilhørende PDD-programmer for at overvinde TDD-metodens ringe produktivitet8 — 9.

Mens humane organoid- og organ-on-chip-modeller kan give vigtig indsigt i sygdomskompleksitet og identifikation af nye lægemidler, er det også stærkt afhængigt af data fra dyremodeller at bringe lægemidler ind i ny klinisk praksis for at vurdere deres effektivitet og sikkerhed. Blandt dem er genetisk modificerede mus bestemt de mest foretrukne pattedyrmodeller. De har mange fordele, da de har en relativt kort generationstid for pattedyr, har mange lignende fænotyper som menneskelige sygdomme og let kan genmanipuleres. De anvendes derfor i vid udstrækning i narkotikaforskningsprogrammer10. Det er dog fortsat en vigtig udfordring at bygge bro over kløften mellem mus og mennesker11. Udviklingen af in vitro-musemodeller svarende til humane organoid- og organ-on-chip-modeller vil i det mindste delvis kunne udfylde dette hul, da det vil muliggøre direkte lægemiddeleffektivitets- og sikkerhedssammenligninger mellem in vivo-data fra mus og in vitro-data fra mennesker.

Her beskrives et vaskulært spiringsassay i museembryoidlegemer (EB’er). Blodkar består af endotelceller (indre foring af karvægge), vægmalerier (vaskulære glatte muskelceller og pericytter)12. Denne protokol er baseret på differentieringen af embryonale stamceller fra mus (mESC’er) i vaskulariserede EB’er ved hjælp af hængende dråber, der rekapitulerer de novo-endotelcelle– og vægmalericelledifferentiering13,14. Muse-ESC’er kan let etableres i kultur fra isolerede dag 3.5 museblastocyster med forskellig genetisk baggrund15. De giver også muligheder for klonanalyse, afstamningssporing og kan let genetisk manipuleres til at generere sygdomsmodeller13,16.

Da blodkar nærer alle organer, er det ikke overraskende, at mange sygdomme, hvis ikke alle, er forbundet med ændringer i mikrovaskulaturen. Under patologiske tilstande kan endotelceller vedtage en aktiveret tilstand eller kan blive dysfunktionelle, hvilket resulterer i vægmaleridød eller migration væk fra blodkar. Disse kan resultere i overdreven angiogenese eller i karsjældenhed, kan fremkalde unormal blodgennemstrømning og defekt blodkarbarriere, der fører til ekstravasation af immunceller og betændelse12,17,18,19. Forskning til udvikling af lægemidler, der modulerer blodkar, er derfor høj, og flere molekylære aktører og koncepter er allerede blevet identificeret til terapeutisk målretning. I denne sammenhæng er den beskrevne protokol særligt velegnet til opbygning af sygdomsmodeller og til lægemiddeltestning, da den rekapitulerer nøglefunktioner i in vivo-spirende angiogenese, herunder valg af endotelspids og stilkcelle, endotelcellemigration og -proliferation, endotelcellevejledning, rørdannelse og rekruttering af vægmalericeller. Det viser også ligheder med nyligt beskrevne 3D vaskulære assays baseret på humane iPSC-teknologier20.

Protocol

1. Medieforberedelse og kultur af mESC Forbered konditioneret medium +/- (CM+/-) ved hjælp af tilskuddet 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) medium med 10% (vol/vol) varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 0,05 mM β-mercaptoethanol, 1x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA 1x), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat. Forbered konditioneret medium +/+ (CM+/+) ved hjælp af tilskuddet CM+/- medium med leukæmihæmmende faktor (LIF) (1.500 U / ml) og 0,1 mM β-mercaptoethanol. Der fremstilles kond…

Representative Results

Protokoloversigten over blodkarspiringsanalysen er vist i figur 1. Ni dage gamle EB’er afledt af tre uafhængige 129/Ola mESC-linjer (Z/Red, R1 og E14) blev enzymatisk dissocieret til enkeltceller ved hjælp af collagenase A. Celler blev farvet for PECAM-1 og analyseret ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) som beskrevet. Alle cellelinjerne udviste robust endoteldifferentiering, og der blev ikke observeret forskelle i deres evne til at differentiere sig til endotelceller. Alle celle…

Discussion

Denne protokol beskriver et upartisk, robust og reproducerbart 3D EB-baseret vaskulært spiringsassay, der kan screenes for lægemidler og gener, der modulerer angiogenese. Denne metode giver fordele i forhold til mange udbredte todimensionelle (2D) assays ved anvendelse af endotelcellekulturer såsom humane navlestrengendotelceller (HUVEC’er) til overvågning af migration (lateral ridseanalyse eller Boyden-kammerassayet)22,23 eller proliferation (tælling af celleantal, påvisning af DNA-syntese, påvisning a…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND og af Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

Materials

2-mercaptoethanol Milipore, Merck 805740 Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar Noble Difco, BD Pharmigen 214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG Life technologies A21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) BD Biosciences 551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95) BD Biosciences 553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope ZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) Peprotech 450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R Beckman Coulter 392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) Telstar 133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm Marienfeld 640211
Cell culture dishes 60 x 15mm Corning 353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mm Corning 353801
Cell culture plates 12-well Corning 3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Biorad 1855196
Chicken serum Sigma-Aldrich C5405
CHIR-99021 (CT99021) HCl Selleckchem S2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg Corning 354249
Collagenase A Roche 10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 Leica
Cover glasses, 24 × 50 mm Vwr 631-0146
DAPT γ‑secretase inhibitor Sigma Aldrich D5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone BioXcell BP0060
DC101 isotype rat IgG1 BioXcell BP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438-5X Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Gibco, Thermofisher scientific 14200067
EDTA 40 mM Gibco, Thermofisher scientific 15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum Gibco, Thermofisher scientific 16141-079 Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415R Eppendorf AG  Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) Roche 11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units  1 mL) Milipore, Merck ESG1107
Falcon tubes 15 mL Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mL Greiner Bio-0ne 227270
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 Greiner Bio-One 739288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 Greiner Bio-One 771288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 Greiner Bio-One 740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) Sigma Aldrich F3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) Biolegend 400605
Fluorscent mounting media DAKO S3023
Gascompress Cutisoft 45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm Bsn Medical 45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003 Whatman WHA10547922
Gelatin solution, type B Sigma-Aldrich G1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM) Gibco, Thermofisher scientific 21710082
IHC Zinc Fixative BD Pharmigen 550523
IncuSafe CO2 Incubator PHCBi MCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6) Roche 11138600001
L-Glutamine 200 mM Gibco, Thermofisher scientific 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco, Thermofisher scientific 11140035
Microscope slide box Kartell Labware 278
Microscope slide, Starfrost Knittel glass VS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer Qiagen QT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer Qiagen QT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00114576
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts  (2 M) Gibco, Thermofisher scientific A24903 Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) ATCC SCRC-1033 Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)].
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)].
Mouse embryonic stem cells line E14 Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001).
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) ATCC SCRC-1011 Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)].
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-1000
PD0325901 Selleckchem S1036
PDGF-BB, Recombinant Human Peprotech 100-14B
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse BD Biosciences 550274
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) Gibco, Thermofisher scientific 15140122
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile Greiner Bio-One 633181
Pipetboy acu 2 Integra-Biosciences 155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200G Gilson F144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G Gilson F167360
Recombinant Human BMP-4 Protein R&D Systems 314-BP
RNeasy Plus mini Kit QIAGEN 74134
Serological pipettes, 10 mL Greiner Bio-One 607 180
Serological pipettes, 25 mL Greiner Bio-One 760 180
Serological pipettes, 5 mL Greiner Bio-One 606 180
Sodium hydroxide (NaOH) Merck 106498
Sodium pyruvate 100 mM Gibco, Thermofisher scientific 11360039
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap Corning 352235
Thermal cycler, T100 Biorad 1861096
Triton X-100 (BioXtra) Sigma Aldrich T9284
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco, Thermofisher scientific 15250061
Trypsin (2.5%) Gibco, Thermofisher scientific 15090046
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL Corning 430758
VEGFA165 , recombinant murine Peprotech 450-32
Water, Sterile Fresenius-Kabi B230531
Waterbath, Lab-Line Digital Thermo Fischer Scientific 18052A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington’s disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bio-ingénierie. 7 (1), 17 (2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

Tags

In VitroSprouting AngiogenesisMouse Embryonic Stem CellsVascular Disease ModelingDrug TestingEndothelial Tip CellsCell MigrationGenetic ScreeningPluripotencyKaryotypingMesoderm DifferentiationLow Attachment Polystyrene Dishes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Galaris, G., Thalgott, J. H., Teston, E., Lebrin, F. P. In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing. J. Vis. Exp. (171), e62554, doi:10.3791/62554 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image