Detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia
Summary
Aquí introducimos un procedimiento para medir oligomeros proteicos y agregación en lysato celular y células vivas utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia.
Abstract
La agregación de proteínas es un sello distintivo de los trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer (AD), la enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de Huntington (EH), etc. Para detectar y analizar oligomeros o agregados de proteínas solubles o difusas, se ha utilizado espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), que puede detectar la velocidad de difusión y el brillo de una sola partícula con una sola sensibilidad a moléculas. Sin embargo, el procedimiento adecuado y el know-how para la detección de agregación de proteínas no han sido ampliamente compartidos. Aquí, mostramos un procedimiento estándar de medición del FCS para las propiedades de difusión de proteínas propensas a la agregación en lysato celular y células vivas: fragmento carboxil-terminal de 25 kDa asociado al ELA de ADN TAR/proteína de unión al ARN 43 kDa (TDP25) y desmutasa de superóxido 1 (SOD1). Los resultados representativos muestran que una parte de los agregados de proteína fluorescente verde (GFP) etiquetados TDP25 se incluyó ligeramente en la fracción soluble de neuroblastoma murino Neuro2a lisato celular. Además, el SOD1 etiquetado con GFP que lleva mutación asociada a la ELA muestra una difusión más lenta en las células vivas. En consecuencia, aquí introducimos el procedimiento para detectar la agregación de proteínas a través de su propiedad de difusión utilizando FCS.
Introduction
Se sabe que las agregaciones proteicas que involucran trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, etc.en 1, son tóxicas y perturbarían la homeostasis proteica (proteostasis) en las células y órganos, que luego podrían conducir al envejecimiento2. Se espera que el aclaramiento de la agregación de proteínas sea una estrategia terapéutica; sin embargo, todavía no se han establecido productos químicos que prevengan la formación de agregación de proteínas y degraden los agregados proteicos (por ejemplo, moléculas pequeñas o fármacos). Además, la forma en que la agregación de proteínas ejerce toxicidad sigue siendo esquiva. Por lo tanto, para promover proyectos de investigación relacionados con la agregación de proteínas, es importante introducir procedimientos de alto rendimiento para simplemente detectar la agregación de proteínas. La detección de agregación de proteínas utilizando anticuerpos que reconocen la conformación de la agregación de proteínas y el tinte fluorescente específico de la agregación se ha utilizado ampliamente3. Sin embargo, es difícil detectar la agregación, especialmente en las células vivas utilizando tales procedimientos clásicos.
La transferencia de energía por resonancia Förster (FRET) es un procedimiento para detectar la agregación de proteínas y los cambios estructurales. Sin embargo, FRET es incapaz de analizar la dinámica proteica (por ejemplo, difusión y oligomerización de proteínas en células vivas)3. Por lo tanto, presentamos aquí un protocolo simple para detectar la agregación de proteínas en solución (por ejemplo, lisato celular) y células vivas utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), que mide la propiedad de difusión y el brillo de moléculas fluorescentes con sensibilidad de molécula única4. FCS es un método de conteo de fotones mediante el uso de un microscopio confocal de escaneo láser (LSM). Utilizando un detector de fotones altamente sensible y el cálculo de la función de autocorrelación (ACF) del tiempo de llegada del fotón, se mide el paso a través del tiempo y el brillo de las moléculas fluorescentes en el volumen de detección. La difusión se ralentiza con un aumento del peso molecular; por lo tanto, la interacción intermolecular se puede estimar utilizando FCS. Aún más potente, un aumento en el brillo de la molécula fluorescente indica la homo-oligomerización de las moléculas. Por lo tanto, fcs es una herramienta poderosa para detectar dicha agregación de proteínas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En cuanto a la calibración del sistema antes de las mediciones, se deben utilizar los mismos cristalerías que la utilizada para medir la muestra (por ejemplo, la cámara de vidrio de cubierta de 8 pozos para el lisato celular y la placa base de vidrio de 35 mm para células vivas). Debido a la adsorción de Rh6G en el vidrio, su concentración efectiva a veces puede disminuir. Si es así, se debe utilizar una solución Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, solo para el ajuste del agujero. Se deben evitar tasas de rec…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K. recibió el apoyo de una Beca de Ayuda para la Investigación Científica (C) (#18K06201) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS), mediante una subvención de la Fundación Nakatani para contramedidas contra nuevas infecciones por coronavirus, mediante una subvención de la Oficina de La Universidad de Hokkaido para el Desarrollo de Futuros Líderes de Investigación (L-Station), y una subvención en ayuda de la Fundación Hoansha. M. K. recibió el apoyo parcial de una Beca JSPS de Investigación Científica sobre Áreas Innovadoras “Química para Biosistemas de Hacinamiento Multimolecular” (#20H04686), y una Subvención JSPS de Ayuda para la Investigación Científica en Áreas Innovadoras “Física de la Información de asuntos vivos” (#20H05522).
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
