الجراحة ومعالجة العينة للتصوير المترابط للصمام الرئوي مورين
Summary
هنا، نقوم بوصف سير عمل مترابط لتكسير الصمام الرئوي المورين والضغط عليه وتركيبه وتصويره لتحديد التركيب الإجمالي وهياكل المصفوفة خارج الخلية المحلية.
Abstract
الأسباب الكامنة وراء أمراض صمام القلب ذات الصلة (HVD) بعيد المنال. نماذج مورين توفر أداة ممتازة لدراسة HVD، ومع ذلك، فإن الخبرة الجراحية والآلات اللازمة لتحديد بدقة هيكل وتنظيم عبر جداول طول متعددة قد توقف تقدمها. يقدم هذا العمل وصفا مفصلا لتشريح المورين ، وتلطيخ الكتلة ، ومعالجة العينات ، وإجراءات التصوير المترابط لتصوير صمام القلب على نطاقات طول مختلفة. تم استخدام الضغط عبر الصمام الهيدروستاتيكي للسيطرة على التغايرية الزمنية عن طريق إصلاح كيميائيا تشكيل صمام القلب. تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT) لتأكيد هندسة صمام القلب وتوفير مرجع لمعالجة العينة المصب اللازمة للفحص المجهري الإلكتروني لمسح الوجه التسلسلي (SBF-SEM). تم التقاط صور عالية الدقة للمصفوفة خارج الخلية (ECM) وإعادة بنائها لتوفير تمثيل محلي ثلاثي الأبعاد لمؤسستها. ثم تم ربط طرق التصوير μCT و SBF-SEM للتغلب على الاختلاف المكاني عبر الصمام الرئوي. وعلى الرغم من أن العمل المقدم يقتصر على الصمام الرئوي، فإن هذه المنهجية يمكن اعتمادها لوصف التنظيم الهرمي في النظم البيولوجية، وهي محورية بالنسبة لتوصيف الهيكلي عبر مقاييس متعددة الطول.
Introduction
يعمل الصمام الرئوي (PV) على ضمان تدفق الدم أحادي الاتجاه بين البطين الأيمن والشريان الرئوي. ترتبط تشوهات الصمام الرئوي بعدة أشكال من أمراض القلب الخلقية. العلاج الحالي لأمراض صمام القلب الخلقية (HVD) هو إصلاح الصمام أو استبدال الصمام ، والذي يمكن أن يستلزم عمليات جراحية متعددة الغازية طوال عمر المريض1. وقد تم قبول على نطاق واسع أن وظيفة صمام القلب مشتقة من هيكلها، وغالبا ما يشار إليها باسم وظيفة هيكل مترابطة. وبشكل أكثر تحديدا، فإن الخصائص الهندسية والميكاميكية الحيوية للقلب تملي وظيفته. الخواص الميكانيكية، بدورها، يتم تحديدها من خلال تكوين وتنظيم ECM. من خلال تطوير طريقة لتحديد الخصائص الميكانيكية الحيوية لصمامات القلب مورين، يمكن استخدام نماذج الحيوانات المعدلة وراثيا لاستجواب دور ECM على وظيفة صمام القلب والخللالوظيفي 2،3،4،5.
لطالما اعتبر نموذج المورين معيارا للدراسات الجزيئية لأن النماذج المعدلة وراثيا متاحة بسهولة أكبر في الفئران مقارنة بالأنواع الأخرى. نماذج مورين المعدلة وراثيا توفر منصة متعددة للبحث في الأمراض المرتبطة بصمام القلب6. ومع ذلك، كانت الخبرة الجراحية ومتطلبات الأجهزة لتوصيف كل من الهندسة وتنظيم ECM عقبة رئيسية في تقدم أبحاث HVD. توفر البيانات الهستولوجية في الأدب صورة في محتوى مصفوفة صمام القلب المورين خارج الخلية ، ولكن فقط في شكل صور 2D ، وغير قادرين على وصف هندسته المعمارية ثلاثية الأبعاد7و8. بالإضافة إلى ذلك، يكون صمام القلب غير متجانس مكانيا وزمانيا، مما يجعل من الصعب استخلاص استنتاجات عبر التجارب المتعلقة بتنظيم ECM إذا لم يتم إصلاح أخذ العينات والتطابق. لا توفر طرق التوصيف ثلاثي الأبعاد التقليدية، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو تخطيط صدى القلب ثلاثي الأبعاد، الدقة اللازمة لحل مكونات ECM9و10.
هذا العمل تفاصيل سير العمل المترابطة تماما حيث تم تناول التغايرية الزمنية بسبب دورة القلب عن طريق تحديد تشكيل الكهروضوئية مورين مع الضغط عبر الصمام الهيدروستاتيكي. تم التحكم في التغايرية المكانية بدقة عن طريق أخذ عينات المناطق ذات الاهتمام وتسجيل مجموعات البيانات من طرائق التصوير المختلفة ، وتحديدا μCT وكتلة المسلسل مسح المجهر الإلكتروني ، عبر مقاييس طول مختلفة. وقد اقترح هذا الأسلوب من الكشفية مع μCT لتوجيه أخذ العينات المصب سابقا، ولكن لأن الصمام الرئوي يحمل الاختلاف الزمني، كان هناك حاجة إلى مستوى إضافي من السيطرة على المستوى الجراحي11.
في دراسات الجسم الحي التي تصف الميكانيكا الحيوية صمام القلب مورين متناثرة، وبدلا من ذلك، تعتمد على النماذج الحاسوبية عند وصف سلوك تشوه. ومن الأهمية بمكان أن تكون البيانات المحلية خارج الخلية على مقياس طول نانومتر ذات صلة بهندسة وموقع صمام القلب. وهذا بدوره يوفر توزيعات قابلة للقياس الكمي ورسم خرائط مكانية لبروتينات ECM المساهمة ميكانيكيا ، والتي يمكن استخدامها لتعزيز نماذج صمام القلب الميكانيكية الحيوية الموجودة12و13و14.
Protocol
Representative Results
Discussion
إزالة البطينين يخدم غرضين. أولا، تعريض جانب البطين للضغط الجوي، وبالتالي يحتاج فقط إلى تطبيق ضغط عبر الصمام من الجانب الشرياني للصمام الرئوي لإغلاق، وثانيا، توفير قاعدة مستقرة لمنع التواء الجذع الرئوي. أثناء الضغط ، ينتقص الجذع الرئوي بشكل شعاعي وأقل شأنا ، مما يجعله عرضة للالتواء ، مما ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل، جزئيا، من قبل R01HL139796 وR01HL128847 المنح إلى CKB و RO1DE028297 وCBET1608058 لDM.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
