मुरीन पल्मोनरी वाल्व के सहर्पेलेटिव इमेजिंग के लिए सर्जरी और नमूना प्रसंस्करण
Summary
यहां, हम सकल संरचना और स्थानीय बाह्य मैट्रिक्स संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए मुरीन पल्मोनरी वाल्व की उत्तेजना, दबाव, निर्धारण और इमेजिंग के लिए एक सहसंबद्ध कार्यप्रवाह का वर्णन करते हैं।
Abstract
हृदय वाल्व संबंधित रोग (एचवीडी) के अंतर्निहित कारण मायावी हैं। मुरीन पशु मॉडल एचवीडी का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं, हालांकि, कई लंबाई के तराजू में संरचना और संगठन को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए आवश्यक सर्जिकल और वाद्य विशेषज्ञता ने इसकी उन्नति को अवरुद्ध कर दिया है। यह काम विभिन्न लंबाई तराजू पर दिल के वाल्व को चित्रित करने के लिए मुरीन विच्छेदन, एन ब्लॉक धुंधला, नमूना प्रसंस्करण और सहसंबद्ध इमेजिंग प्रक्रियाओं का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। हाइड्रोस्टैटिक ट्रांसवैलिवुलर दबाव का उपयोग हृदय वाल्व संरचना को रासायनिक रूप से ठीक करके लौकिक विषमता को नियंत्रित करने के लिए किया जाता था। माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी) का उपयोग हृदय वाल्व की ज्यामिति की पुष्टि करने और सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम) के लिए आवश्यक डाउनस्ट्रीम नमूना प्रसंस्करण के लिए एक संदर्भ प्रदान करने के लिए किया गया था। एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन सीरियल एसईएम छवियों को अपने संगठन का स्थानीय 3 डी प्रतिनिधित्व प्रदान करने के लिए लिया गया और खंगाला गया। μCT और SBF-SEM इमेजिंग विधियों तो फेफड़े के वाल्व भर में स्थानिक भिन्नता को दूर करने के लिए सहसंबद्ध थे । हालांकि प्रस्तुत काम फेफड़े के वाल्व पर विशेष रूप से है, इस पद्धति जैविक प्रणालियों में पदानुक्रमित संगठन का वर्णन करने के लिए अपनाया जा सकता है और कई लंबाई तराजू में संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए निर्णायक है ।
Introduction
पल्मोनरी वाल्व (पीवी) सही वेंट्रिकल और पल्मोनरी धमनी के बीच एकदिशात्मक रक्त प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए कार्य करता है। पल्मोनरी वाल्व विकृतियां जन्मजात हृदय रोग के कई रूपों से जुड़ी होती हैं। जन्मजात हृदय वाल्व रोग (एचवीडी) के लिए वर्तमान उपचार वाल्वुलर मरम्मत या वाल्व प्रतिस्थापन है, जो एक मरीज के जीवनकाल1में कई आक्रामक सर्जरी की आवश्यकता कर सकता है। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि दिल के वाल्व का कार्य इसकी संरचना से प्राप्त होता है, जिसे अक्सर संरचना-कार्य सहसंबंधित के रूप में जाना जाता है। अधिक विशेष रूप से, दिल के ज्यामितीय और जैव यांत्रिक गुण इसके कार्य को निर्देशित करते हैं। यांत्रिक गुण, बदले में, ईसीएम की संरचना और संगठन द्वारा निर्धारित किए जाते हैं। मुरीन हार्ट वाल्व के बायोमैकेनिकल गुणों का निर्धारण करने के लिए एक विधि विकसित करके, ट्रांसजेनिक पशु मॉडल का उपयोग हृदय वाल्व समारोह और शिथिलता2,3,4,5पर ईसीएम की भूमिका से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है।
मुरीन पशु मॉडल लंबे समय से आणविक अध्ययन के लिए मानक के रूप में माना जाता है क्योंकि ट्रांसजेनिक मॉडल अन्य प्रजातियों की तुलना में चूहों में अधिक आसानी से उपलब्ध हैं । मुरीन ट्रांसजेनिक मॉडल दिल वाल्व से संबंधित रोगों पर शोध के लिए एक बहुमुखी मंच प्रदान करते हैं6। हालांकि, ज्यामिति और ईसीएम संगठन दोनों की विशेषता के लिए सर्जिकल विशेषज्ञता और इंस्ट्रूमेंटेशन आवश्यकताएं एचवीडी अनुसंधान की प्रगति में एक बड़ी बाधा रही हैं। साहित्य में हस्टोलॉजिकल डेटा मुरीन हार्ट वाल्व एक्सपेरिलिएलर मैट्रिक्स सामग्री में एक तस्वीर प्रदान करता है, लेकिन केवल 2डी छवियों के रूप में, और इसकी 3 डी वास्तुकला7,8का वर्णन करने में असमर्थ हैं। इसके अतिरिक्त, दिल वाल्व दोनों स्थानिक और अस्थायी विषम है, यह मुश्किल ECM संगठन के बारे में प्रयोगों में निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए अगर नमूना और संरचना तय नहीं कर रहे हैं । पारंपरिक 3डी लक्षण वर्णन विधियां, जैसे एमआरआई या 3 डी इकोकार्डियोग्राफी, ईसीएम घटकों को हल करने के लिए आवश्यक संकल्प प्रदान नहीं करते हैं9,10।
यह काम पूरी तरह से सहसंबद्ध कार्यप्रवाह का विवरण देता है जहां कार्डियक चक्र के कारण अस्थायी विषमता को हाइड्रोस्टैटिक ट्रांसवैलर दबाव के साथ मुरीन पीवी की संरचना को ठीक करके संबोधित किया गया था। स्थानिक विषमता को विभिन्न लंबाई के तराजू में, विभिन्न इमेजिंग तौर-तरीकों, विशेष रूप से माइक्रोन और सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से डेटा सेट दर्ज करके रुचि के क्षेत्रों का नमूनाकरण और डेटा सेट दर्ज करके ठीक से नियंत्रित किया गया था। डाउनस्ट्रीम नमूने के मार्गदर्शन के लिए μCT के साथ स्काउटिंग की यह विधि पहले प्रस्तावित की गई है, लेकिन क्योंकि फेफड़े के वाल्व लौकिक भिन्नता प्रदर्शित करते हैं, सर्जिकल स्तर11पर नियंत्रण के एक अतिरिक्त स्तर की आवश्यकता थी।
वीवो अध्ययनों में मुरीन हार्ट वाल्व बायोमैकेनिक्स का वर्णन विरल हैं और इसके बजाय, विरूपण व्यवहार का वर्णन करते समय कम्प्यूटेशनल मॉडल पर भरोसा करते हैं। यह महत्वपूर्ण महत्व का है कि नैनोमीटर लंबाई पैमाने पर स्थानीय बाहुलर डेटा ज्यामिति और हृदय वाल्व के स्थान से संबंधित हो । यह, बदले में, यांत्रिक रूप से योगदान करने वाले ईसीएम प्रोटीन के मात्रात्मक, स्थानिक रूप से मैप किए गए वितरण प्रदान करता है, जिसका उपयोग मौजूदा बायोमैकेनिकलहार्ट वाल्व मॉडल12, 13,14को मजबूत करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वेंट्रिकल्स को हटाने के दो प्रयोजनों में कार्य करता है। सबसे पहले, वायुमंडलीय दबाव के लिए वेंट्रिकल पक्ष को उजागर करना, जिससे केवल फेफड़े के वाल्व के धमनी पक्ष से एक ट्रांसवैलर दबाव को बंद करने की आवश्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम का समर्थन किया है, भाग में, R01HL139796 और R01HL128847 CKB और RO1DE028297 और CBET1608058 DWM के लिए अनुदान ।
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
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