Kirurgi och provbehandling för korrelativ avbildning av murinpulmonellventilen
Summary
Här beskriver vi ett korrelativt arbetsflöde för excision, trycksättning, fixering och avbildning av murinpulmonell ventilen för att bestämma bruttokonformationen och lokala extracellulära matrisstrukturer.
Abstract
De underliggande orsakerna till hjärtklaff relaterade-sjukdom (HVD) är svårfångade. Murine djurmodeller är ett utmärkt verktyg för att studera HVD, men den kirurgiska och instrumentella expertis som krävs för att exakt kvantifiera strukturen och organisationen över flera längdskalor har hämmat dess framsteg. Detta arbete ger en detaljerad beskrivning av murin dissekering, en block färgning, prov bearbetning och korrelativa bildframställning förfaranden för att avbilda hjärtklaffen i olika längdskalor. Hydrostatiskt transvalvulärt tryck användes för att kontrollera temporal heterogenitet genom att kemiskt fixa hjärtklaffen konformation. Mikrotomografi (μCT) användes för att bekräfta hjärtklaffens geometri och ge en referens för den nedströms provbehandling som behövs för seriell block ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM). Högupplösta seriella SEM-bilder av den extracellulära matrisen (ECM) togs och rekonstruerades för att ge en lokal 3D-representation av sin organisation. μCT och SBF-SEM bildframställning metoder var sedan korrelerade för att övervinna rumsliga variationen över pulmonell ventilen. Även om det arbete som presenteras uteslutande är på lungventilen, kan denna metodik antas för att beskriva den hierarkiska organisationen i biologiska system och är avgörande för den strukturella karakteriseringen över flera längdskalor.
Introduction
Lungventilen (PV) tjänar till att säkerställa enkelriktat blodflöde mellan rätt ventrikel och lungartären. Lungventil missbildningar är associerade med flera former av medfödd hjärtsjukdom. Den nuvarande behandlingen för medfödd hjärtklaffsjukdom (HVD) är valvulär reparation eller ventilbyte, vilket kan kräva flera invasiva operationer under patientens livstid1. Det har allmänt accepterats att hjärtklaffens funktion härrör från dess struktur, ofta kallad strukturfunktionen korrelerar. Mer specifikt dikterar hjärtats geometriska och biomekaniska egenskaper dess funktion. De mekaniska egenskaperna bestäms i sin tur av ECM: s sammansättning och organisation. Genom att utveckla en metod för att bestämma de biomekaniska egenskaperna hos murinhjärtaventiler kan transgena djurmodeller användas för att förhöra ECM: s roll på hjärtklaffens funktion och dysfunktion2,3,4,5.
Murindjursmodellen har länge betraktats som standard för molekylära studier eftersom transgena modeller är mer lättillgängliga hos möss jämfört med andra arter. Murin transgena modeller ger en mångsidig plattform för forskning av hjärtklaffrelaterade sjukdomar6. Men de kirurgiska kraven på expertis och instrumentering för att karakterisera både geometrin och ECM-organisationen har varit ett stort hinder för att gå vidare med HVD-forskningen. Hstologiska data i litteraturen ger en bild i murin hjärtklaff extracellulär matrisinnehåll, men endast i form av 2D-bilder, och kan inte beskriva dess 3D-arkitektur7,8. Dessutom är hjärtklaffen både rumsligt och tidsmässigt heterogen, vilket gör det svårt att dra slutsatser över experiment om ECM-organisation om provtagningen och konformationen inte är fixad. Konventionella 3D-karakteriseringsmetoder, såsom MRI eller 3D-ekokardiografi, ger inte den upplösning som krävs för att lösa ECM-komponenterna9,10.
Detta arbete beskriver ett helt korrelativt arbetsflöde där tidsmässiga heterogenitet på grund av hjärt cykeln åtgärdades genom att fastställa konformationen av murin PV med hydrostatiska transvalvular tryck. Den rumsliga heterogeniteten kontrollerades exakt av provtagningsregioner av intresse och registrering av datauppsättningar från olika bildframställningsmetoder, särskilt μCT och seriell block ansiktsskanning elektronmikroskopi, över olika längdskalor. Denna metod för scouting med μCT för styrning nedströms provtagning har föreslagits tidigare, men eftersom lungventilen uppvisar tidsvariation, behövdes en ytterligare kontrollnivå på kirurgisk nivå11.
In vivo-studier som beskriver murin hjärtklaff biomekanik är glesa och förlitar sig istället på beräkningsmodeller när man beskriver deformationsbeteendet. Det är av avgörande betydelse att lokala extracellulära data på nanometerlängdsskalan är relaterade till hjärtklaffens geometri och placering. Detta ger i sin tur kvantifierbara, rumsligt kartlagda fördelningar av mekaniskt bidragande ECM-proteiner, som kan användas för att förstärka befintliga biomekaniska hjärtklaffmodeller12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avlägsnande av ventriklarna tjänar två syften. Först exponera ventrikelsidan för atmosfärstrycket och behöver därmed bara applicera ett transvalvulärt tryck från lungventilens kranskärlssida för att stänga och för det andra, vilket ger en stabil bas för att förhindra vridning av lungstammen. Under trycksattisering distends lungstammen radiellt och sämre, vilket gör den benägen att vrida, vilket orsakar kollapsen av lungstammen. Förladdning av lungventilen med en saltlösning ger en extra kvalitetskont…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds delvis av R01HL139796 och R01HL128847 bidrag till CKB och RO1DE028297 och CBET1608058 för DWM.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
