JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

Published: June 13, 2021
doi:
10.3791/62592
, , , , ,
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry,University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine,Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences,University of Auckland

Summary

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae’de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1’in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1’in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Abstract

ABC taşıyıcılarının başarılı biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu büyük ölçüde heterolog ekspresyon sisteminin seçimine bağlıdır. Son yirmi yılda, birçok önemli mantar zarı proteinini incelemek için kullanılan bir maya zarı proteini ekspresyon platformu geliştirdik. Ekspresyon konağı Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ yedi büyük endojen ABC taşıyıcılarında silinir ve genomik PDR5 lokusunda tek kopya olarak bıçaklanmış heterolog membran protein genlerinin konsitütif aşırı ekspresyonunu sağlayan fonksiyon kazancı mutasyonu ile pdr1-3 transkripsiyon faktörünü içerir. Çok yönlü plazmid vektörlerin oluşturulması ve tek adımlı klonlama stratejilerinin optimizasyonu, heterolog ABC taşıyıcılarının hızlı ve doğru klonlanmasını, mutajenizini ve ekspresyonunu sağlar. Burada, yeni bir proteaz-bölünebilir mGFPHis çift etiketinin geliştirilmesini ve kullanımını anlatıyoruz (yani, monomerik maya geliştirilmiş yeşil floresan protein yEGFP3 altı-histidin benzeşim saflaştırma etiketine kaynaşmış) etiketin ilgi proteini ile olası müdahalesini önlemek ve O etiketinin nikel benzeşim reçinelerine bağlama verimliliğini artırmak için tasarlanmıştır. mGFPHis’in membran proteini ORF’ye (açık okuma çerçevesi) füzyonu, poliakrilamid jellerin incelenmesi ve mGFPHis etiketini koruyan bozulma ürünlerinin tespiti ile proteinin kolayca ölçülmesini sağlar. Bu özelliğin membran proteini çözünürlüğü için deterjan taramayı nasıl kolaylaştırdığını gösteriyoruz. S. cerevisiae ADΔΔ’de aşırı ifade edilen C-terminal etiketli Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1’in küçük ölçekli plazma membran preparatlarının verimli, hızlı ve güvenilir izolasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu küçük ölçekli plazma membran izolasyon protokolü, tek bir iş günü içinde yüksek kaliteli plazma membranları üretir. Plazma membran preparatları Cdr1 ve Cdr1 mutant varyantlarının enzim aktivitelerini belirlemek için kullanılabilir.

Introduction

İntegral membran proteinlerinin doğal lipit ortamlarından çıkarılması, yapılarını ve işlevlerini önemli ölçüde etkileyebilir1,2,3,4. Biyolojik membranların karmaşık lipit bileşimi5, kritik öneme sahip protein-lipit etkileşimlerinin gerçekleşebilmesini sağlar6. Lipitler membran proteinlerinin yapısal bütünlüğünü korur, böylece membran bölmesi hedeflerinde(ler) 7,8‘de doğru çalışmasını sağlar. Bu nedenle, membran proteini saflaştırmasında kritik bir ilk adım, proteinin yapısını ve/veya işlevini etkilemeden doğal ortamından çıkarılmasıdır.

Çoğu hidrofobik doğası ile ilgili olan membran proteinlerinin yapısını ve X-ışını kristalografisi veya kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) 9 , 10,11,12içingerekli miktarlarda düzgün katlanmış ve fonksiyonel membran proteinlerini ifade etmenin zorluklarının karakterizesinde birçok engel vardır. Üç tür membran protein ekspresyon sistemi vardır: homolog9, heterolog13,14,15ve in vitro ekspresyon sistemleri16,17. Birçok ifade sisteminin genellikle düşük ifade seviyeleri veya yasaklayıcı maliyetleri, membran proteinleri üretmek için tercih edilen seçenek olarak sadece birkaç ana bilgisayar bırakır. Bakteri konakçısı, Escherichia coli, S. cerevisiae ve Pichia pastoris mayalarıve Sf9 böcek hücreleri veya memeli hücre hatları18gibi daha yüksek ökaryotlar içerir. Tüm membran protein ekspresyon teknolojilerinin avantajları ve dezavantajları vardır; bununla birlikte, S. cerevisiae belki de membran protein üretimi için uygun en iyi çalışılan ökaryotik model organizmadır. Genetik mühendisliği, ilaç keşfi, sentetik biyoloji ve ökaryotik membran proteinlerinin ekspresyasyonu14 , 19,20,21’dekiuygulamalarla çok yönlüdür.

Bu çalışmada, büyük C. albicans multidrug efflux pompaCdr1’i aşırı ifade etmek ve incelemek için S. cerevisiae ADΔ14 ve ADΔΔ 22 tercih edilen konaklar ( Şekil1A)ile patentli bir S. cerevisiae membran protein ekspresyon teknolojisi21 kullanılmıştır. Her iki S. cerevisiae suşu da AD1-8utürevleridir –23, URA3 veya HIS1 genomik loci’deki istenmeyen entegrasyon yoluyla ortaya çıkan yanlış pozitif urasil veya histidin prototroph dönüştürücülerini ortadan kaldırmak için silinen ura3 (ADΔ) veya hem ura3 hem de onun1 (ADΔΔ) genlerine sahiptir. Şekil 1A’dabelirtilen 7 büyük multidrug efflux pompa23’ünsilinmesi, ADΔΔ’yi çoğu ksenobiyotiklere karşı mükemmel derecede hassas hale getirir. Fonksiyon kazancı mutant transkripsiyon faktörü Pdr1-3, Cdr1 (Şekil 1A’dakikırmızı sekizgenler) gibi heterolog membran proteinlerinin konsitülatif aşırı ekspresyonuna neden olur. heterolog-ORF içeren dönüşüm kasetinin (Şekil 1A) genomik PDR5 lokusunda (Şekil 1A’damavi dikdörtgen) iki homolog rekombinasyon olayı ile entegrasyonu. C-terminal mGFPHis etiketli proteinlerin uygun plazma membran lokalizasyonu konfokal mikroskopi (Şekil 1A) ile doğrulanabilir ve O etiketi etiketli proteinin nikel benzeşim saflaştırılması için kullanılabilir. Bazı mantar ABC taşıyıcılarının (örneğin, Candida krusei ABC1)pABC3 türevi plazmidlere klonlamaları, ancak hücre toksisitesi nedeniyle Escherichia coli’de yayılamadıkları için mümkün değildi. Bu,14,24 membran proteinlerinin N veya C-terminuslarında çeşitli benzeşim, epitop veya muhabir etiketleriyle etiketlenmiş tek adımlı klonlamanın doğrudan S. cerevisiae ADΔΔ’ye(Şekil 1C)geliştirilmesine neden oldu. S. cerevisiae Çeşitli CDR1 mutantlarını aşırı ifade eden ADΔΔ suşları, 25 bp(Şekil 1C)ile çakışan beş adede kadar ayrı PCR parçası kullanılarak da verimli bir şekilde oluşturulabilir. Bu protokolü kullanarak, birçok ilgi çekici ORF çok kısa bir süre içinde düşük maliyetle ve yüksek verimlilikle klonlanabilir, ifade edilebilir ve karakterize edilebilir. Dönüşüm verimliliği, her ek PCR parçasıyla yalnızca ~2 kat azaltır. 

İstenirse, ifade düzeyleri, genellikle yüksek, kesin ifade düzeylerinin% 0,1-% 50’si arasında herhangi bir yere kadar ifade düzeylerini tahmin edilebilir şekilde ayarlamak için astar tasarımı tarafından kolayca manipüle edilebilir25. Optimize edilmiş, çok fonksiyonlu, pABC314 türev klonlama vektörü, pABC3-XLmGFPHis26 (Şekil 1B) bir HRV-3C proteaz bölünme bölgesi (X; LEVLFQ| GP), sık kullanılan tütün etch virüsünden (TEV) daha iyi performans gösteren bir proteaz27. L beş amino asit (GSGGS) bağlayıcıdır, mGFP bir monomerik mutanttır (A206K)28,maya geliştirilmiş yeşil floresan protein varyantı yEGFP330’un29 versiyonudur ve His üç amino asit bağlayıcıdır (GGS) ve ardından altı-histidin (HHHHHH) nikel benzeşim proteini saflaştırma etiketidir.

Bu ifade teknolojisi ilaç keşfinde ve membran proteinlerinin incelenmesinde başarıyla kullanılmıştır. Mantar azol ilaç hedefi olan S. cerevisiae Erg1131için ilk yapı bu teknoloji kullanılarak çözüldü. Ayrıca C. albicans Cdr132 , 33,34’ün ayrıntılı karakterizasyonunu ve gelecekteki yüksek çözünürlüklü yapıları doğrulamak için sistein çapraz bağlama çalışmalarına uygun sistein eksikliği olan bir Cdr1 molekülü35’in oluşturulmasını sağladı. Büyük insan mantar patojenlerinden diğer birçok ABC taşıyıcısı (yani, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei ve Fusarium solani tür kompleksi) de bu ifade platformu24, 36,37,38,39kullanılarak ayrıntılı olarak incelenmiştir. Bu, yeni floresan efflux pompa substratı Nil kırmızısı 40 ve spesifik 41 ve geniş spektrumlu 14 ,33,42 , 43 ,44 efflux pompa inhibitörlerini keşfetmek için yüksek verimli ekranlarda kullanılanefflux pompalarını aşırı ifade eden bir S. cerevisiae suşları panelinin üretilmesini sağlamıştır. Bu sistemin kullanımı ayrıca clorgyline’ın türünün ilk geniş spektrumlu mantar çokdrug efflux pompa inhibitörü42olarak keşfedilmesini sağladı.

Membran proteinlerinin tam çözünmesi ve endojen lipitlerden yoksun homojen bir membran protein-misel preparatının oluşturulması, yüksek deterjan konsantrasyonları gerektirir45. Ancak ne yazık ki, bu genellikle membran proteini 5 ,8,45,46‘yıda devre dışı bırakmaktadır. Deterjan monomerlerinin özellikleri ve çözeltideki toplamaları, hidrofobik kuyruğun fiziksel özelliklerinden, alkil zincirinin uzunluğundan ve dallanmasından, aromatik bir çekirdeğin veya floroalkil yan zincirin varlığından veya polioksiyetil ünitelerin sayısından etkilenir. Bu nedenle deterjan taraması, membran proteini çözünmesi ve saflaştırılması için en uygun deterjanı belirlemek için önemli bir ilk adımdır.

C. albicans ciddi, hayatı tehdit eden invaziv enfeksiyonlara neden olabilen immün sistemi baskılanmış bireylerin önemli bir insan mantar patojenidir47ve azol antifungal ilaçlara dirençli hale gelebilir48,49. C. albicans multidrug direncinin ana mekanizmalarından biri Cdr150plazma membranında bulunan ABCG alt familyasının tip II ATP bağlayıcı kaseti (ABC) taşıyıcı51’dir. Tam boyutlu mantar ABCG taşıyıcıları (iki nükleotid bağlama etki alanı [NBD] ve iki transmembran etki alanından [TMD]) daha yaygın olarak pleiotropik ilaç direnci (PDR) taşıyıcıları olarak bilinir ve benzersiz ters etki alanı topolojisi [NBD-TMD]2ile karakterize edilir. PDR taşıyıcıları sadece52, 53ve mantar54 bitkilerinde bulunur. Önemlerine rağmen, PDR taşıyıcıları için hiçbir yapı yoktur, ancak insan yarı boyutlu ABCG taşıyıcıları için yapılar son zamanlarda cdr133için ilk belirsiz modelin oluşturulmasına yardımcı olan çözülmüştür. Bununla birlikte, son deneysel kanıtlarımız, bu modelin muhtemelen kusurlu olduğunu göstermektedir, çünkü mantar PDR taşıyıcıları karakteristik asimetrik NBD’lere sahiptir ve bu da muhtemelen benzersiz bir taşıma mekanizmasıyla sonuçlanır. Bu nedenle, Cdr1’in yüksek çözünürlüklü bir yapısı, hem efflux aracılı ilaç direncinin üstesinden gelmeye yardımcı olabilecek yeni efflux pompa inhibitörlerinin rasyonel tasarımı hem de bu önemli ABC taşıyıcı ailesinin etki mekanizması hakkında içgörüler sağlamak için gereklidir.

Bu çalışmanın amacı, Cdr1 için yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek amacıyla, genetiği değiştirilmiş S. cerevisiae ekspresyon konağında Cdr1’in ekspresyasyonu, çözünürlüğü ve saflaştırılması için güvenilir protokoller geliştirmekti. Bu sürecin bir parçası olarak, proteaz-bölünebilir mGFPHis çift etiket (Şekil 1B) etiketi Cdr1’in C-terminusundan ayıran 16 kalıntılı bir bağlayıcı ile tasarlanmıştır, bu da ekli 6x Benzeşim etiketinin nikel benzeşim reçinesine bağlanmasını iyileştirdi ve cdr1 ifade seviyelerinin canlı hücrelerde ve tüm saflaştırma işlemi sırasında izlenmesini sağladı. Cdr1’in biyokimyasal karakterizasyonu için kullanılabilecek, yaklaşık% 10 C. albicans Cdr1 (SDS-PAGE’den sonra Coomassie boyama ile tahmin edildiği gibi) içeren küçük ölçekli maya plazma membran protein preparatları için tekrarlanabilir bir protokol de geliştirilmiştir.

Protocol

1. Taze veya dondurulmuş dönüşüm stoklarının hazırlanması yetkin ADΔ ve ADΔΔ hücreleri 2x YPCD’nin 25 mL’sini aşılayın [yani, 2x YPD; %2 (w/v) maya özü, %2 (w/v) pepton, %4 (w/v) dekstroz), %0,079 CSM (tam takviye karışımı)] Tek maya kolonili35 ortam ve dakikada 200 devirde (rpm) sallanarak 30 °C’de 16 saat boyunca gece boyunca kuluçkaya yatırın. 25 mL o/n kültürü ile 225 mL 2x YPCD ortamını aşıla ve hücre optik yoğunluğunu 600 nm’de (OD…

Representative Results

pYES2(Şekil 2B)ile S. cerevisiae ADΔΔ’nin (~4 x10 4 transformant/μg) yüksek dönüşüm sıklığı elde edildi. Beklendiği gibi, DNA (yani, yalnızca ddH2O) kontrolü dönüştürücü vermedi ve doğrusal CDR1-mGFPHis dönüşüm kasetinin 1 μg’si (Şekil 1A) optimize edilmiş ADΔΔ dönüşüm protokolü ile ~50 dönüştürücü (Şekil 2C) verdi. CDR1-mGFPHis…

Discussion

Membran proteinlerinin yapısal analizindeki son ilerlemeye rağmen, Cdr1 veya başka bir PDR taşıyıcısı için 3D yapı mevcut değildir. Bu nedenle, Cdr1 yapısı ve biyokimyasal özellikleri hakkında bilgi edinmek önemlidir, çünkü bu sadece efflux aracılı ilaç direncinin üstesinden gelmek için yeni ilaçların rasyonel tasarımı hakkında değil, aynı zamanda ABC proteinlerinin önemli bir alt familyasının işlev mekanizmasına da içgörü sağlayacaktır.

Membran protein…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Yeni Zelanda Marsden Fonu’ndan (Grant UOO1305) ve Chulalongkorn Üniversitesi, Bangkok, Tayland Tıp Fakültesi’nden (M. Niimi) bir blok hibeyi minnetle kabul ediyorlar. Otago Üniversitesi’ne G. Madani’ye doktora bursu sağladığı için teşekkür etmek istiyorlar. Yazarlar ayrıca Profesör Stefan Raunser ve meslektaşları Dr. Amir Apelbaum ve Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam’a, G. Madani’nin Max Planck Moleküler Fizyoloji Enstitüsü’nde (MPIMP), Dortmund, Almanya’da 6 aylık ziyaretinde destekleri ve gözetimleri için şükranlarını sunmak istiyor. Yazarlar ayrıca Alman Akademik Değişim Servisi’ne (DAAD) G. Madani’ye MPIMP’yi ziyaret etmesi için bir araştırma hibesi (57381332) sağladığı için teşekkür ediyor.

Materials

2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S –
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. . Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins–a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochimie. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Génétique. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5′ proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D., Prasad, R. . Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. , 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

Keywords: Plasma MembraneCandida AlbicansCdr1-mGFPHisMembrane ProteinSmall-scale IsolationATPaseDetergentCell HarvestingPre-cultureCell LysisCentrifugationHomogenization Buffer
check_url/fr/62592?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image