カンジダ・アルビカンスCdr1-mGFPHisの分析のための小スケールプラズマ膜調製
Summary
本稿では、サッカロマイセス・セレビシエで過剰発現したカンジダ・アルビカンスABC(ATP結合カセット)タンパク質Cdr1の特性評価のための小規模な血漿膜分離プロトコルを提示する。プロテアーゼ切開性C末端mGFPCdr1とタグの間に16残基リンカーを備えた二重タグは、Cdr1の精製および洗剤スクリーニングを容易にするように設計された。
Abstract
ABCトランスポーターの生化学的および生物物理学的特徴付けの成功は、異種発現系の選択に大きく依存する。過去20年間、私たちは多くの重要な真菌膜タンパク質を研究するために使用されてきた酵母膜タンパク質発現プラットフォームを開発しました。発現宿主 サッカロミセス・セレビシエ ADΔΔは、7つの主要な内因性ABC輸送体で削除され、ゲノム PDR5 遺伝子座の単一コピーとして安定的に統合された異種膜タンパク質遺伝子の構成過剰発現を可能にする機能獲得変異を有する転写因子Pdr1-3を含む。多目的なプラスミドベクターの作成とワンステップクローニング戦略の最適化により、迅速かつ正確なクローニング、突然変異誘発、および異種ABCトランスポーターの発現が可能になります。ここでは、新規プロテアーゼクレアブルmGFPHis二重タグ(すなわち、単量体酵母強化された緑色蛍光タンパク質yEGFP3を6ヒスチジンアフィニティー精製タグに融合)の開発と使用について説明し、目的のタンパク質とのタグの干渉を避け、ニッケル樹脂親和性への彼のタグの結合効率を高めるために設計された。mGFPHisを膜タンパク質ORF(オープンリーディングフレーム)に融合させることにより、ポリアクリルアミドゲルの検査や、mGFPHisタグを保持する分解物の検出により、タンパク質の定量が容易になります。この機能が膜タンパク質可溶化のための洗剤スクリーニングを促進する方法を示す。C末端にタグ付けされた カンジダ・アルビカンス 多剤流出トランスポーターCdr1の効率よく、迅速かつ信頼性の高い分離のためのプロトコルが 、S.cerevisiae ADΔで過剰発現して提示される。この小規模なプラズマ膜絶縁プロトコルは、1営業日以内に高品質の形質のプラズマ膜を生成します。血漿膜製剤は、Cdr1およびCdr1変異体変異体の酵素活性を決定するために使用することができる。
Introduction
その本来の脂質環境からのインテグラル膜タンパク質の抽出は、その構造と機能1、2、3、4に劇的に影響を与える可能性があります。生物学的膜5の複雑な脂質組成は、極めて重要なタンパク質と脂質相互作用が6に起こり得る。脂質は膜タンパク質の構造的完全性を維持し、膜コンパートメントの宛先7,8で正しく機能することを可能にする。したがって、膜タンパク質精製における重要な第一歩は、その構造および/または機能に影響を与えることなく、その天然環境からのタンパク質の抽出である。
膜タンパク質の構造を特徴付けるには多くの障害があり、そのほとんどが疎水性に関連しており、X線結晶学やクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)9、10、11、12に必要な量で適切に折り畳まれた機能性膜タンパク質を発現しにくい。膜タンパク質発現系には、相同9、異種13、14、15、およびインビトロ発現系16,17の3種類があります。多くの発現系の発現レベル、または非常に低いコストは、膜タンパク質を産生するための好ましい選択肢として少数の宿主しか残さない。それらは、細菌宿主、大腸菌、酵母S.セレビシエおよびピキアパストリス、およびSf9昆虫細胞または哺乳動物細胞株18のような高等の真核生物を含む。すべての膜タンパク質発現技術には長所と短所があります。しかし、S.セレビシエは、おそらく膜タンパク質産生に適した最も研究された真核生物である。遺伝子工学、創薬、合成生物学、真核細胞膜タンパク質14、19、20、21の発現の用途で非常に汎用性が高い。
本研究では、特許取得済みのS.セレビシエ膜タンパク発現技術21を使用し、S.セレビシエADΔ14およびADΔ2を好ましい宿主として(図1A)、主要なC.アルビカンス多剤流出ポンプCdr1を過剰発現および研究した。S.セレビシエ株はいずれも、ウラ3(ADΔ)またはura3およびhis1(ADΔ)遺伝子の両方を有するAD1-8u-23の誘導体であり、URA3またはHIS1ゲノム座遺伝子で望ましくない統合を通じて生じる偽陽性ウラシルまたはヒスチジン原発性形質転換体を排除するために削除される。 図1Aに示されている7つの主要な多剤流出ポンプ23の欠失は、ADΔΔを最も異種生物に絶妙に敏感にする。機能の得る変異型転写因子Pdr1-3は、2つの相同性の変異体を介して、異種-ORF含有変換カセット(図1A)の異種-ORF含有変換カセット(図1A)を統合した後、Cdr1(図1Aの赤い八角形)のような異種膜タンパク質の構成過剰発現を引き起こす。C末端mGFPの適切な原形質膜局在化タグ付きタンパク質は共焦点顕微鏡(図1A)によって確認することができ、Hisタグはタグ付きタンパク質のニッケル親和性精製に使用することができる。いくつかの真菌性ABCトランスポーター(例えば、カンジダ・クルセイABC1)をpABC3由来プラスミドにクローニングすることは、細胞毒性のために大腸菌に伝播することができなかったため不可能であった。これにより、膜タンパク質14、24のワンステップクローニングの開発を促し、様々な親和性、エピトープ、またはレポータータグをS.cerevisiae ADΔに直接タグ付けしたN末端またはC末端のいずれかでタグ付けされた(図1C)。S.セレビシエ種々のCDR1変異体を過剰発現するADΔ株も、25bpで重複する最大5個の個別PCR断片を用いることで効率的に作成することができる(図1C)。このプロトコルを採用することで、対象となる多くのORFを、非常に短い期間内で低コストで高効率でクローン化、表現、および特徴付けることができます。変換効率は、PCRフラグメントを追加するたびに〜2倍にしか減少しません。
必要であれば、発現レベルは、通常高い構成式レベル25の0.1%~50%の間の任意の場所まで予測可能に発現レベルを調整するために、プライマー設計によって容易に操作することもできる。最適化された多機能pABC314誘導クローニングベクター、pABC3-XLmGFPHis26(図1B)にはHRV-3Cプロテアーゼ切断部位(X;レフフ|GP)、頻繁に使用されるタバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ27よりも4°Cで優れたパフォーマンスを発揮するプロテアーゼである。Lは5アミノ酸(GSGGS)リンカーであり、mGFPは、単量体変異体(A206K)28、29バージョンの酵母強化された緑色蛍光タンパク質変異体yEGFP330であり、Hisは3つのアミノ酸リンカー(GGS)であり、続いて6-ヒスチジン(HHHHHH)ニッケル親和性タンパク質精製タグである。
この発現技術は、創薬や膜タンパク質の研究に成功しています。真菌アゾール薬標的の最初の構造であるS.セレビシエErg1131は、この技術を用いて解決された。また、C.アルビカンスCdr132、33、34の詳細な特徴付けと、システイン架橋研究に適したシステイン欠損Cdr1分子35の作成を可能にし、将来の高解像度構造を検証した。主要なヒト真菌病原体からの他の多くのABC輸送者(すなわち、 C.アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・オーリス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ユティリス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス・フミガトゥス、ペニシリウム・マルネッフェイ、フザリウム・ソラニ族群)もこの発現プラットフォーム24、36、37、38を用いて詳細に研究されている。これにより、ハイスループットスクリーンで使用されている流出ポンプを過剰発現するS.cerevisiae株のパネルを生成し、新しい蛍光流出ポンプ基板ナイルレッド40と特定の41と広域スペクトル14、33、42、43、44の流出ポンプ阻害剤を発見することができました。 このシステムの使用はまた、その種の広域スペクトル真菌多剤流出ポンプ阻害剤42の最初としてclorgylineの発見を可能にした。
膜タンパク質の完全な可溶化と、内因性脂質を欠いた均質な膜タンパク質ミセル調製物の作成には、高い洗剤濃度45が必要である。しかし、残念ながら、これはまた、多くの場合、膜タンパク質5、8、45、46を不活性化します。溶液中の洗浄剤モノマーの特性およびそれらの凝集は、疎水性尾部の物理的性質、アルキル鎖の長さおよび分岐、芳香核またはフルオロアルキル側鎖の存在、またはポリオキシエチレン単位の数によって影響される。したがって、洗浄剤スクリーニングは、膜タンパク質の可溶化および精製に最も適した洗剤を決定するための重要な第一歩である。
C. アルビカンスは、深刻な、生命を脅かす侵襲性感染症47を引き起こす可能性がある免疫不全個体の主要なヒト真菌病原体であり、そして、それは、アゾール抗真菌薬48、49に耐性を持つことができる。C.アルビカンス多剤耐性の主なメカニズムの1つは、Cdr150の過剰発現であり、これは、原形質膜に位置するABCGサブファミリーのII型ATP結合カセット(ABC)トランスポーター51である。フルサイズの真菌性ABCGトランスポーター(2つのヌクレオチド結合ドメイン[NBD]および2つの膜貫通ドメイン[TMD]からなる)は、より一般的に多発性薬物耐性(PDR)トランスポーターとして知られており、そのユニークな逆ドメイントポロジ[NBD-TMD]2によって特徴付けられる。PDRトランスポーターは、植物52、53および真菌54にのみ見られる。その重要性にもかかわらず、PDRトランスポーターのための構造はありませんが、人間のハーフサイズのABCGトランスポーターの構造は最近解決され、Cdr133の最初の仮モデルを作成するのに役立ちました。しかし、我々の最近の実験的証拠は、真菌PDRトランスポーターが特徴的な非対称NBDを有し、おそらくユニークな輸送メカニズムをもたらすため、このモデルに欠陥があることを示唆している。したがって、Cdr1の高解像度構造は、流出媒介性を克服するのに役立つ可能性のある新規排出ポンプ阻害剤の合理的設計と、この重要なABCトランスポーターファミリーの作用機序に関する洞察を提供するために必要とされる。
本研究の目的は、Cdr1の高解像度構造を得ることを究極の目的とし、遺伝子組み換え S.セレビシエ 発現宿主におけるCdr1の発現、可溶化、精製のための信頼できるプロトコルを開発することであった。このプロセスの一環として、プロテアーゼ切開可能なmGFPHisダブルタグ(図1B)は、Cdr1のC末端からタグを分離する16残基リンカーで設計され、ニッケル親和性樹脂への6x Hisアフィニティタグの結合を改善し、生細胞および精製プロセス全体におけるCdr1発現レベルのモニタリングを可能にした。約 10%C.アルビカン Cdr1(SDS-PAGE後のクマシー染色によって推定される)を含む小規模酵母血漿膜タンパク質調製物の再現性プロトコルも開発され、Cdr1の生化学的特性解析に使用できる。
Protocol
Representative Results
Discussion
膜タンパク質の構造解析の最近の進歩にもかかわらず、Cdr1または他のPDRトランスポーターの3D構造は現在利用できません。したがって、Cdr1構造とその生化学的特徴に関する知識を得ることは重要であり、流出媒介性を克服するための新薬の合理的な設計に関する洞察を提供するだけでなく、ABCタンパク質の重要なサブファミリーの機能のメカニズムにも洞察を提供する。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ニュージーランド・マースデン基金(グラントUOO1305)からの資金援助と、タイのバンコクにあるチュラロンコン大学医学部からのブロック補助金(M.Niimi)を感謝しています。彼らは、G.マダニに博士課程の奨学金を提供してくれたオタゴ大学に感謝したいと考えています。著者らはまた、ステファン・ラウンサー教授と同僚のアミール・アペルバウム博士とデイヴァナヤガバラシー・ヴィナヤガム博士が、ドイツのマックス・プランク分子生理学研究所(MPIMP)で6ヶ月間のG.マダニ訪問の支援と監督に感謝したいと考えている。著者らはまた、MpIMPを訪問するための研究助成金(57381332)をG.マダニに提供してくれたドイツ学術交流サービス(DAAD)に感謝しています。
Materials
| 2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) | Merck | 77-86-1 | |
| 2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG310S | LMNG |
| 2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside | Anatrace | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
| 2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG322S | DMNG |
| 4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside | Glycon Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-α-M |
| 40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) | Bio-Rad | 1610148 | |
| Acetic acid (glacial) | Merck | 64-19-7 | |
| Agar | Formedium | 009002-18-0 | |
| Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | 13106-76-8 | |
| Ammonium persulphate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| ATP disodium salt | sigma-Aldrich | A-6419 | |
| Bromophenol blue | SERVA Electrophoresis GmbH | 34725-61-6 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | |
| CHAPSO | Anatrace | C317S | |
| CSM | Formedium | DCS0019 | |
| CSM minus uracil | Formedium | DCS0161 | |
| Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C324S | CYMAL-4 |
| Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C327S | CYMAL-7 |
| Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C321S | CYMAL-1 |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 11024-24-1 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche Diagnostics | 10197785103 | |
| DMSO | Merck | 67-68-5 | |
| Ethanol | Merck | 459836 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | Applied Biosystems | 78205 | A blend of exonuclease and phosphatase |
| Glucose | Formedium | 50-99-7 | |
| Glycerol | Merck | 56-81-5 | |
| Glycine | Merck | G8898 | |
| HEPES | Formedium | 7365-45-9 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003172510 | |
| KOD Fx Neo | TOYOBO Co | KFX-201 | Use for reliable colony PCR |
| lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
| Magnesium chloride hexa-hydrate | sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES | Formedium | 145224-94-8 | |
| n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide | Anatrace | H110S | HEGA-10 |
| n-Decanoyl-N-methyl-glucamide | Anatrace | M320S | MEGA-10 |
| n-Decyl-phosphocholine | Anatrace | F304S | Fos-choline-10 |
| n-Decyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D322S | DM |
| n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ312S | Anzergent 3-12 |
| n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide | Anatrace | D360S | LDAO |
| n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside | Anatrace | D310HA | α-DDM |
| n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310S | β-DDM |
| n-Nonyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Nonyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | N330S | NM |
| n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ318S | Anzergent 3-18 |
| n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ308S | Anzergent 3-8 |
| n-Octyl-phosphocholine | Anatrace | F300S | Fos-choline-8 |
| n-Octyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | O311S | OG |
| n-Tetradecyl-phosphocholine | Anatrace | F312S | Fos-choline-14 |
| n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | T315S | TDM |
| n-Tridecyl-phosphocholine | Anatrace | F310S | Fos-choline-13 |
| n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | T323S | – |
| n-Undecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | U300S | UM (UDM) |
| N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Octylphenoxypolyethoxyethanol | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | TRITON X-100 |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Peptone | Formedium | 3049-73-7 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Diagnostics | 329-98-6 | |
| Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase | New England Biolabs | M0535S | High-fidelity DNA polymerase |
| polyethylene glycol (PEG 3350) | Sigma-Aldrich | 25322-68-3 | |
| polyoxyethylenesorbitan monooleate | Sigma-Aldrich | 9005-65-6 | TWEEN 80 |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P8394 | |
| Protein Assay Kit | Bio-Rad | 5000122 | RC DC Protein Assay Kit II |
| QC Colloidal Coomassie Stain | Bio-Rad | 1610803 | |
| Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) | Abcam | AB116028 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | 151-21-3 | SDS |
| Sodium L-ascorbate BioXtra | Sigma-Aldrich | 11140 | |
| Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350S | DDS |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Yeast extract | Formedium | 008013-01-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| Equipment (type) | |||
| Centrifuge (Eppendorf 5804) | Eppendorf | ||
| Centrifuge (Beckman Ultra) | Beckman | ||
| Centrifuge (Sorvall RC6) | Sorvall | ||
| FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) | Bio-Rad | ||
| Gel imaging (GelDoc EZ Imager) | Bio-Rad | ||
| Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) | BioTek Instruments | ||
| PCR thermal cycler (C1000 Touch) | Bio-Rad | ||
| Power supply (PowerPac) | Bio-Rad | ||
| SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) | Bio-Rad | ||
| Shaking incubator (Multitron) | Infors HT, Bottmingen | ||
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | GE17-5172-01 | |
| UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) | Amersham BioSciences UK Ltd | ||
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