胚発生から変性までの椎間板の光学断面化と可視化
Summary
光断面化法を用いて椎間板のアヌル線維化における空間的軟骨細胞組織を調べる方法を提示する。
Abstract
椎間板(IVD)変性は腰痛の主な原因であり、罹患した個人に対して高い障害を伴う。ディスクの変性を解読し、再生アプローチを開発するためには、IVDの細胞生物学を完全に理解することが不可欠です。この生物学の1つの側面は、細胞が生理学的状態と変性の間にどのように空間的に配置されているかという問題です。IVDの生物学的性質とその可用性により、この組織を分析することは困難です。本研究では、初期胚発生から末期変性まで、アヌル線維症における空間的軟骨細胞組織を調査する。脊椎手術を受けた患者から得られた動物モデルやヒト円盤組織として、牛胚組織を用いた高分解能染色解析を行うため、光学断面化法(Apotome)を適用します。初期胚性牛円盤中の非常に高い軟骨細胞密度から、細胞の数は妊娠、成長、および成熟の間に減少する。ヒトのディスクでは、細胞密度の増加が組織変性の進行を伴った。関節軟骨で既に実証されているように、クラスター形成は高度なディスク変性の特徴を表す。
Introduction
椎間板(IVD)は、生化学的に、そして細胞アーキテクチャに関して、一見すると、多くの点で関節軟骨1に似ている軟骨系の構造である。実際、関節軟骨のIVD変性と変形性関節症(OA)の両方が軟骨摩耗、軟骨下嚢胞および骨棘形成、及び軟骨下硬化症2、3による関節空間狭小化を特徴とする。これらの類似点にもかかわらず、両方の組織のアーキテクチャと機能的役割が異なります。関節軟骨のマトリックスは主にアーケード形成コラーゲンII型ネットワークで形成されていますが、IVDは3つの異なるタイプの組織で構成されています:中央のコラーゲンII型が豊富なパルポスス核は、軸負荷を取り込み、それらを細密に詰まった円形コラーゲンI型繊維の包含リングに送信します。その機能は、引張縦繊維強度を持つプロテオグリカンおよび水が豊富な核によって受け取られる変換された軸圧力を吸収することです。各核の上部と下部とアヌラスでは、ヒアリン軟骨エンドプレートが隣接する椎骨4との接合部を形成する(図1)。
関節軟骨では、4つの異なる空間軟骨細胞パターンが見つけられる:対、文字列、二重弦、小さな大きなクラスター5、6、7(図2)。このパターンの変更は、OA の発症と進行に関連付けられます8,9。空間的軟骨細胞組織はまた、軟骨の直接的な機能的性質、すなわちその剛性を示し、この画像ベースのグレーディングアプローチ10,11の機能的関連性を強調する。これらのパターンは、さらに既存の臨床利用可能な技術12で同定することができる。IVDと関節軟骨の類似性により、特徴的な軟骨細胞パターンもIVDに存在すると仮定することができます。クラスター形成は、退化したIVD13、14にも認められる現象である。
IVDで空間細胞組織を分析しようとする場合、関節軟骨を調査する際に存在しないいくつかの技術的な困難を克服する必要があります。
まず、組織自体の処理は、コラーゲンII型で構成される均質なヒアリン軟骨よりもはるかに困難です。IVDの主な繊維成分はコラーゲンタイプIであり、組織学的な薄い部分を生成することがはるかに困難になります。ヒアリン関節軟骨では、組織の「ガラス状」の性質により厚い切片でも容易に分析できるが、IVDのコラーゲン型I型ネットワークは光学的に高い可知性である。このため、IVDの神学では、強いバックグラウンドノイズが一般的な問題です。この光学的に密な組織を浸透するための迅速かつ安価な方法は、例えば、アポトームによって光学断面化装置の使用である。このようなアポトームでは、従来の蛍光顕微鏡の照明経路にグリッドが挿入される。グリッドの前に平面平行ガラス板が配置されます。これは前後に傾き、3つの異なる位置にイメージ内のグリッドを投影します。各 Z 位置に対して、投影グリッドを持つ 3 つの未加工イメージが作成され、重ね合わせられます。特別なソフトウェアによって、焦点外光を計算することができる。基本的な原則は、グリッドが表示されている場合、その情報がフォーカスされていない場合は、フォーカスが外されていると見なされるということです。この技術により、適切に焦点を合わせ、高解像度の画像を適度な時間で取得できます。
第二に、組織は人間のドナーから来るのが難しい。膝の全置換を行う場合、関節の全面を得て手術中にさらなる分析を行うことができる。ジ関節関節の変形性関節症は関節全体の疾患でもあるが、関節の一部の領域がそのまま残っている軟骨の質には依然として強い焦点差があるが、例えばその領域の負荷が減少したためである。この状況は、通常、ディスクがグローバルに破壊されたときにのみ手術が行われるIVDでは異なります。手術室からヒトドナーから組織を得るとき、組織も高度に断片化されており、さらなる分析を行う前に、IVDの3つの軟骨タイプのいずれかに組織を正しく割り当てる必要があります。また、より大きな組織切片のより詳細な分析を可能にし、IVDの胚発生を調べるためには、動物モデル生物の選択が必要である。
このようなモデル生物を選択する場合、その解剖学的および寸法、その機械的負荷、現在の細胞集団ならびに組織組成に関して、ヒトディスクと同等のシステムを有することが重要である。ここで提示された技術の目的のために、我々は牛腰椎椎椎組織の使用を示唆する:その低い再生電位をもたらすヒトディスクの重要な特性は、核内の成熟中の脊索細胞の喪失である。しかし、多数のモデル生物において、脊索細胞は生涯を通じて検出することができる。羊、ヤギ、軟骨栄養症犬などの脊索細胞を失う少数の動物のほとんどは、人間のディスクよりもはるかに小さいIVDを持っています。ヒトIVDの直径に匹敵する矢状円盤径を有する腰部ウシディスク15.
初期のディスク変性につながる重要な要因は、過度の機械的負荷です。腰椎の立っている牛の円盤内圧は、背骨が水平に整列した約0.8 MPaです。驚くべきことに、これらの圧力は、勃起したヒト脊椎(0.5MPa)15,16について報告された腰部の椎間板内圧に匹敵する。また、ウシディスク中の水およびプロテオグリカンの量は、若いヒト17からのIVDのそれと同等である。したがって、運動セグメントの実際の移動パターンは、二足歩行動物と二足歩行動物では異なるかもしれないが、総負荷およびディスク特性に関しては、牛は羊や犬などのIVDの他の確立された動物モデルよりもはるかに人間の生物学に近い。
このプロトコルでは、初期胚発生から末期変性まで空間軟骨細胞組織の観点からIVDの変化を解析する方法を提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
モザイクイメージングと光学断面化により増強された蛍光顕微鏡を用いて、開発、成熟、変性を通じて、腰椎IVDのアヌルにおける軟骨細胞の空間配置を評価した。椎間板変性のために脊椎手術を受けた患者から変性組織を採取することができたが、胚期および成熟期の分析にはモデル生物(ウシ)の使用が必要であった。初期の胚発生時に高い細胞密度がアヌラスで注目された。開発のさらな?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、彼らの助けとサポートのために元の出版物からの私たちの共同執筆者に感謝します。シャーロット・エマ・バンバーガーがアポトーム画像の取得を手伝ってくれたことに感謝します。
Materials
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. . Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated’: a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
