Optische sectie en visualisatie van de tussenwervelschijf van embryonale ontwikkeling tot degeneratie
Summary
We presenteren een methode om ruimtelijke chondrocytenorganisatie in de anulus fibrosus van de tussenwervelschijf te onderzoeken met behulp van een optische sectioningmethode.
Abstract
Intervertebral disc (IVD) degeneratie is een belangrijke oorzaak van lage rugpijn en het brengt een hoge mate van stoornis met zich mee voor de getroffen personen. Om schijfdegeneratie te decoderen en regeneratieve benaderingen te kunnen ontwikkelen, is een grondig begrip van de cellulaire biologie van de IVD essentieel. Een aspect van deze biologie dat nog steeds onbeantwoord blijft, is de vraag hoe cellen ruimtelijk zijn gerangschikt in een fysiologische toestand en tijdens degeneratie. De biologische eigenschappen van de IVD en de beschikbaarheid ervan maken dit weefsel moeilijk te analyseren. De huidige studie onderzoekt de ruimtelijke chondrocytenorganisatie in de anulus fibrosus van vroege embryonale ontwikkeling tot eindstadium degeneratie. Een optische sectioningmethode (Apotome) wordt toegepast om kleuringsanalyses met hoge resolutie uit te voeren met behulp van runderembryonaal weefsel als diermodel en menselijk schijfweefsel verkregen van patiënten die een wervelkolomoperatie ondergaan. Van een zeer hoge chondrocytendichtheid in de vroege embryonale runderschijf neemt het aantal cellen af tijdens de dracht, groei en rijping. In menselijke schijven ging een toename van de cellulaire dichtheid gepaard met de progressie van weefseldegeneratie. Zoals al was aangetoond in gewrichtskraakbeen, vertegenwoordigt clustervorming een kenmerkend kenmerk van geavanceerde schijfdegeneratie.
Introduction
De tussenwervelschijf (IVD) is een op kraakbeen gebaseerde structuur die biochemisch en met betrekking tot cellulaire architectuur op het eerste gezicht in veel opzichten lijkt op het gewrichtskraakbeen1. Inderdaad, zowel IVD-degeneratie als artrose (OA) van gewrichtskraakbeen worden gekenmerkt door gewrichtsruimtevernauwing als gevolg van kraakbeenslijtage, subchondrale cyste en osteofytvorming en subchondrale sclerose2,3. Ondanks deze schijnbare overeenkomsten verschillen de architectuur en de functionele rol van beide weefsels. Terwijl de matrix van gewrichtskraakbeen voornamelijk wordt gevormd door een arcadevormend collageen type II-netwerk, bestaat de IVD uit drie verschillende soorten weefsel: de collageentype II-rijke nucleus pulposus in het midden neemt axiale belastingen op en brengt ze over naar een omvattende ring van dicht opeengepakte cirkelvormige collageen type I-vezels die anulus fibrosus wordt genoemd. Hun functie is om de vertaalde axiale drukken te absorberen die worden ontvangen door de proteoglycaan- en waterrijke kern met hun treklengte vezelsterkte. Aan de boven- en onderkant van elke kern en anulus vormt een hyalien kraakbeenachtige endplate de kruising met de aangrenzende wervels4 (figuur 1).
In gewrichtskraakbeen zijn vier verschillende ruimtelijke chondrocytenpatronen te vinden: paren, snaren, dubbele snaren, kleine respectievelijk grote clusters5,6,7 ( figuur2). Veranderingen in dit patroon zijn geassocieerd met het begin en de progressie vanartrose 8,9. Ruimtelijke chondrocytenorganisatie is ook indicatief voor een directe functionele eigenschap van kraakbeen, namelijk de stijfheid ervan, wat de functionele relevantie van deze beeldgebaseerde beoordelingsbenadering10,11onderstreept. Deze patronen kunnen bovendien worden geïdentificeerd met reeds bestaande klinisch beschikbare technologie12. Vanwege de overeenkomsten tussen de IVD en gewrichtskraakbeen, kan worden verondersteld dat karakteristieke chondrocytenpatronen ook aanwezig zijn in de IVD. Clustervorming is een fenomeen dat ook wordt waargenomen in de gedegenereerde IVD13,14.
Bij het analyseren van ruimtelijke cellulaire organisatie in de IVD, is het noodzakelijk om verschillende technische problemen te overwinnen die niet aanwezig zijn bij het onderzoeken van gewrichtskraakbeen:
Ten eerste is de verwerking van het weefsel zelf veel uitdagender dan bij het homogene hyaliene kraakbeen dat grotendeels bestaat uit collageen type II. De belangrijkste vezelcomponent van de IVD is collageen type I, waardoor het veel moeilijker wordt om dunne histologische secties te genereren. Terwijl in het hyaliene gewrichtskraakbeen zelfs dikke delen gemakkelijk kunnen worden geanalyseerd vanwege de “glasachtige” aard van het weefsel, is het collageentype I-netwerk van de IVD optisch zeer ondoordringbaar. Om deze reden is een sterk achtergrondgeluid een veel voorkomend probleem in de histologie van de IVD. Een snelle en goedkope manier om dit optisch dichte weefsel binnen te dringen is het gebruik van een optisch sectioning apparaat, bijvoorbeeld door middel van een Apotome. In zo’n Apotome wordt een raster ingevoegd in het verlichtingspad van een conventionele fluorescentiemicroscoop. Voor het rooster is een vlak-parallelle glasplaat geplaatst. Deze kantelt heen en weer waardoor het raster in het beeld in drie verschillende posities wordt geprojecteerd. Voor elke z-positie worden drie raw-afbeeldingen met het geprojecteerde raster gemaakt en over elkaar heen gelegd. Door middel van speciale software kan het onscherpe licht worden uitgerekend. Het onderliggende principe is dat, als het raster zichtbaar is, die informatie in focus is, zo niet wordt het als onscherp beschouwd. Met deze techniek kunnen goed gefocuste en hoge resolutie beelden in een redelijke hoeveelheid tijd worden verkregen.
Ten tweede is het weefsel moeilijk te verkrijgen van menselijke donoren. Bij het uitvoeren van totale knievervanging kan het volledige oppervlak van het gewricht worden verkregen voor verdere analyse tijdens de operatie. Hoewel artrose van een diarthrodiaal gewricht ook een ziekte van het hele gewricht is, zijn er toch sterke focale verschillen in de kwaliteit van het kraakbeen waarbij meestal sommige delen van het gewricht nog intact zijn, bijvoorbeeld door verminderde belasting in dat gebied. Deze situatie is anders in de IVD, waar een operatie meestal alleen wordt uitgevoerd wanneer de schijf wereldwijd is vernietigd. Bij het verkrijgen van weefsel van menselijke donoren uit de operatiekamer, is het weefsel ook sterk gefragmenteerd en is het noodzakelijk om het weefsel correct toe te wijzen aan een van de drie kraakbeentypen van de IVD voordat verdere analyses worden uitgevoerd. Om meer gedetailleerde analyses van ook grotere weefselsecties mogelijk te maken en om de embryonale ontwikkeling van de IVD te onderzoeken, is de keuze van een diermodelorganisme daarom noodzakelijk.
Bij het kiezen van een dergelijk modelorganisme is het belangrijk om een systeem te hebben dat vergelijkbaar is met de menselijke schijf met betrekking tot zijn anatomie en afmetingen, zijn mechanische belasting, de huidige celpopulatie en zijn weefselsamenstelling. Voor het doel van de gepresenteerde techniek hier stellen we het gebruik van bovien lumbaal schijfweefsel voor: een kritieke eigenschap van de menselijke schijf die resulteert in zijn lage regeneratieve potentieel is het verlies van notochordale cellen tijdens rijping in de kern. In tal van modelorganismen kunnen notochordale cellen echter hun hele leven lang worden gedetecteerd. De meeste van de weinige dieren die hun notochordale cellen verliezen, zoals schapen, geiten of chondrodystrofehonden, hebben een IVD die veel kleiner is dan menselijke schijven. Alleen lumbale runderschijven aanwezig met een vergelijkbare sagittale schijfdiameter als die van menselijke IVD’s15.
Een belangrijke factor die leidt tot vroege schijfdegeneratie is overmatige mechanische belasting. De intradiscale druk van een staande koe in de lumbale wervelkolom is ongeveer 0,8 MPa met de wervelkolom horizontaal uitgelijnd. Verrassend genoeg zijn deze drukken vergelijkbaar met de lumbale intradiscale drukken gerapporteerd voor de rechtopstaande menselijke wervelkolom (0,5 MPa)15,16. Ook de hoeveelheid water en proteoglycanen in runderschijven is vergelijkbaar met die van de IVD van jonge mensen17. Daarom, hoewel het werkelijke bewegingspatroon van de bewegingssegmenten bij viervoetige dieren kan verschillen van de tweevoetige mens, staat de koe met betrekking tot de totale belasting en schijfkenmerken veel dichter bij de menselijke biologie dan andere gevestigde diermodellen voor de IVD zoals schapen en honden.
In dit protocol presenteren we een techniek hoe veranderingen in de IVD kunnen worden geanalyseerd vanuit het oogpunt van ruimtelijke chondrocytenorganisatie van vroege embryonale ontwikkeling tot eindstadiumdegeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van fluorescentiemicroscopie aangevuld met mozaïekbeeldvorming en optische sectioning, evalueerden we de ruimtelijke rangschikking van chondrocyten in de anulus van de lumbale IVD gedurende ontwikkeling, rijping en degeneratie. Hoewel degeneratief weefsel kon worden geoogst van patiënten die een wervelkolomoperatie kregen voor schijfdegeneratie, vereiste analyse van de embryonale periode en rijpingsfase het gebruik van een modelorganisme (rund). Hoge cellulaire dichtheden werden opgemerkt in de anulus tijden…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken onze co-auteurs uit de originele publicaties voor hun hulp en steun. We bedanken Charlotte Emma Bamberger voor haar hulp bij het verkrijgen van de apotome-afbeeldingen.
Materials
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. . Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated’: a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
