Denne protokollen beskriver dannelsen av celle som etterligner uni-lipid og multi-lipid vesicles, støttet lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Disse in vitro-modellene kan tilpasses for å inkorporere en rekke lipidtyper og kan brukes til å undersøke ulike molekyl- og makromolekylinteraksjoner.
Modellcellemembraner er et nyttig screeningverktøy med anvendelser som spenner fra tidlig legemiddeloppdagelse til toksisitetsstudier. Cellemembranen er en avgjørende beskyttende barriere for alle celletyper, som skiller de interne cellulære komponentene fra det ekstracellulære miljøet. Disse membranene består i stor grad av en lipidbilayer, som inneholder ytre hydrofile hodegrupper og indre hydrofobe halegrupper, sammen med ulike proteiner og kolesterol. Lipidenes sammensetning og struktur spiller en avgjørende rolle i reguleringen av biologisk funksjon, inkludert interaksjoner mellom celler og cellulær mikromiljøet, som kan inneholde legemidler, biologiske giftstoffer og miljøgifter. I denne studien beskrives metoder for å formulere uni-lipid og multi-lipid støttet og suspendert celle som etterligner lipid-bilayers. Tidligere ble uni-lipid fosfatidylkolin (PC) lipid bilayers samt multi-lipid placental trophoblast-inspirert lipid bilayers utviklet for bruk i å forstå molekylære interaksjoner. Her vil metoder for å oppnå begge typer bilayermodeller bli presentert. For celler som etterligner multi-lipid bilayers, bestemmes ønsket lipidsammensetning først via lipidekstraksjon fra primære celler eller cellelinjer etterfulgt av flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). Ved hjelp av denne sammensetningen fremstilles lipid vesicles ved hjelp av en tynnfilmhydrerings- og ekstruderingsmetode, og deres hydrodynamiske diameter og zetapotensial er preget. Støttede og suspenderte lipid-bilayers kan deretter dannes ved hjelp av kvartskrystallmikrobalanse med dissipasjonsovervåking (QCM-D) og på en porøs membran for bruk i henholdsvis en parallell kunstig membranpermeabilitetsanalyse (PAMPA). De representative resultatene fremhever reproduserbarhet og allsidighet av in vitro cellemembran lipid bilayer modeller. Metodene som presenteres kan hjelpe til med rask, facile vurdering av interaksjonsmekanismene, som permeasjon, adsorpsjon og innebygging, av ulike molekyler og makromolekyler med cellemembran, som hjelper til med screening av narkotikakandidater og prediksjon av potensiell cellulær toksisitet.
Cellemembranen, som hovedsakelig består av fosfolipider, kolesterol og proteiner, er en avgjørende komponent i alle levende celler1. Med organisering drevet av lipid amfifilitet fungerer cellemembranen som en beskyttende barriere og regulerer hvordan cellen samhandler med omgivelsene2. Flere cellulære prosesser er avhengige av lipid- og proteinsammensetningen av membranen1,2. For eksempel er cellemembraninteraksjoner viktige for effektiv legemiddellevering3. Legemidler, biologer, nanomaterialer, biologiske giftstoffer og miljøgifter kan påvirke integriteten til en cellemembran, og dermed påvirke cellulær funksjon4. Konstruksjonen av in vitro-cellemimikeringsmembranmodeller basert på lipidsammensetningen av cellemembraner har potensial til å gi facile verktøy for å forbedre studiet av den potensielle effekten av disse materialene på celler.
Modell lipid bilayers inkluderer lipid vesicles, støttet lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Støttede lipidbilayere er en modell av fosfolipidcellemembranen som vanligvis brukes i bioteknologiske applikasjoner der lipid vesicles brister på et støttet substratmateriale5,6,7,8,9. En vanlig teknikk som brukes til å overvåke bilayerdannelse er kvartskrystallmikrobalanse med dissipasjonsovervåking (QCM-D), som undersøker adsorpsjon av vesikler i forhold til bulkvæskeegenskapene in situ8,10,11,12,13,14 . Tidligere har QCM-D blitt brukt til å demonstrere at under strømningsforhold, når en kritisk vesicle dekning av fosfatidylkolin (PC) lipid vesikler oppnås på overflaten, bryter de spontant inn i stive lipidbilayers15. Tidligere arbeid har også undersøkt støttet lipidbilayerformasjon med varierende lipidsammensetninger16, inkorporering av lipidproteiner17,18,19, og bruk av polymerputer20, noe som gir støttede lipidbilayere som er i stand til å etterligne ulike aspekter av cellemembranfunksjonen.
Lipid bilayers har blitt brukt til å etterligne ulike biologiske barrierer fra sub-cellulære til organnivåer, inkludert mitokondrie, rød blodlegeme og levercellemembraner ved å endre fosfolipid-, kolesterol- og glykolipidkomponentene21. Disse mer komplekse multi-lipid vesikler kan kreve flere metoder for å oppnå vesicle brudd, avhengig av lipid sammensetningen. For eksempel har tidligere studier brukt et α-spiralisk (AH) peptid avledet fra hepatitt C-virusets ikke-strukturelle protein 5A for å indusere bilayerdannelse ved å destabilisere adsorbert lipid vesikler22,23. Ved hjelp av dette AH-peptidet har støttede lipidbilayere som etterligner placentalceller tidligere blitt dannet24. Det store potensialet for støttede lipidbilayers for biomedisinske applikasjoner har blitt demonstrert med undersøkelser som spenner over molekylær og nanopartikkeltransport25,26, miljøtoksiske interaksjoner27, proteinmontering og funksjon17,18,19, peptidarrangement og innsetting28,29, legemiddelscreening30og mikrofluidiske plattformer31.
Suspendert lipid bilayers har blitt brukt til farmasøytisk screening studier via en parallell kunstig membran permeabilitet analyse (PAMPA) hvor en lipid bilayer er suspendert over en porøs hydrofob innsats32,33,34,35. PAMPA lipidmodeller er utviklet for forskjellige biologiske grensesnitt, inkludert blod-hjerne, bukkal, tarm og transdermale grensesnitt36. Ved å kombinere både de støttede lipid-bilayer- og PAMPA-teknikkene, kan adsorpsjon, permeabilitet og innebygging av forbindelser i lipidkomponenter av ønsket vev eller celletype studeres grundig.
Denne protokollen beskriver fabrikasjon og anvendelse av in vitro cellemembran lipid bilayer modeller for å undersøke flere molekylære interaksjoner. Fremstilling av både uni-lipid og multi-lipid støttet og suspendert lipid bilayers er detaljert. For å danne en støttet lipidbilayer utvikles lipid vesikler først ved hjelp av tynnfilmhydrering og ekstruderingsmetoder etterfulgt av fysisk-kjemisk karakterisering. Dannelse av en støttet lipidbilayer ved bruk av QCM-D-overvåking og fabrikasjon av suspenderte lipidmembraner til bruk i PAMPA diskuteres. Til slutt undersøkes multi-lipid vesicles for utvikling av mer komplekse cellemimikeringsmembraner. Ved hjelp av begge typer fremstilte lipidmembraner demonstrerer denne protokollen hvordan dette verktøyet kan brukes til å studere molekylære interaksjoner. Totalt sett konstruerer denne teknikken cellemimikering lipid bilayers med høy reproduserbarhet og allsidighet.
Denne protokollen tillater dannelse av lipid vesicles, støttede lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Her presenteres kritiske trinn for å danne hver av disse strukturene. Når du danner lipid vesicles, er det viktig å ekstrudere over overgangstemperaturen til lipid39. Når du er under overgangstemperaturen, er lipiden fysisk til stede i sin bestilte gelfase39. I denne bestilte fasen er hydrokarbon lipidhalene fullt utvidet, noe som gjør ekstrudering utfordrende…
The authors have nothing to disclose.
Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation under Grant No. 1942418 tildelt A.S., og et National Science Foundation Graduate Research Fellowship tildelt C.M.B.H., under Grant No. 1644760. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation. Forfatterne takker Dr. Noel Vera-González for lipid vesicle karakterisering datainnsamling. Forfatterne takker professor Robert Hurt (Brown University) for bruken av hans Zetasizer. Forfatterne takker Brown University Mass Spectrometry Facility, spesielt Dr. Tun-Li Shen for hjelp med kvantifisering av lipidsammensetning.
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC, 16:0-18:1 PC) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840034 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) | Avanti Polar Lipids | 850757 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) | Avanti Polar Lipids | 890703 | |
3 mL Luer-Loc syringes | BD | 309657 | |
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner | Duran Wheaton Kimble | W224605 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
Alconox | Fisher Scientific | 50-821-781 | |
Ammonium formate | Millipore Sigma | LSAC70221 | |
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire | Waters | 186002551 | |
Chloroform | Millipore Sigma | LSAC288306 | |
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK | Sarstedt | 67.758.001 | |
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) | Millipore Sigma | 36735 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | LSAC472301 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Filter supports, 10 mm | Avanti Polar Lipids | 610014 | Size for mini extruder |
Folded capillary zeta cell | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764-4L | |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34256 | |
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
LiposoFast ® LF-50 | Avestin, Inc. | ||
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 – 4L | |
Mini-extruder set with holder/heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile | Millipore Sigma | MAIPS4510 | for PAMPA studies |
Nitrogen gas, ultrapure | TechAir | NI T5.0 | |
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um | Whatman | 800309 | Size for mini extruder |
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um | Whatman | 110605 | Size for large extruder |
Parafilm | Bemis | PM999 | |
Phosphate buffer saline (PBS), 10x | Genesee Scienfitic | 25-507X | Dilute to 1x |
Qsoft 401 software | Biolin Scientific | ||
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer | Biolin Scientific | ||
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL | Duran Wheaton Kimble | 986561 | |
Silicon Dioxide, thin QSensors | Biolin Scientific | QSX 303 | |
Sodium chloride (NaCl) | Millipore Sigma | LSACS5886 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-100 | |
Solvent Safe pipette tips | Sigma-Aldrich | S8064 | |
Sphingomyelin (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 860061 | |
Trizma base | Millipore Sigma | LSACT1503 | |
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid | Caisson Labs | TRL01-6X100ML | |
Whatman drain disc, 25 mm | Whatman | 230600 | Size for large extruder |
Zetasizer ZS90 | Malvern Panalytical | ||
Zetasizer 7.01 software | Malvern Panalytical |