Montering av cellemikrokering støttede og suspenderte Lipid Bilayer-modeller for studiet av molekylære interaksjoner

Summary

Denne protokollen beskriver dannelsen av celle som etterligner uni-lipid og multi-lipid vesicles, støttet lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Disse in vitro-modellene kan tilpasses for å inkorporere en rekke lipidtyper og kan brukes til å undersøke ulike molekyl- og makromolekylinteraksjoner.

Abstract

Modellcellemembraner er et nyttig screeningverktøy med anvendelser som spenner fra tidlig legemiddeloppdagelse til toksisitetsstudier. Cellemembranen er en avgjørende beskyttende barriere for alle celletyper, som skiller de interne cellulære komponentene fra det ekstracellulære miljøet. Disse membranene består i stor grad av en lipidbilayer, som inneholder ytre hydrofile hodegrupper og indre hydrofobe halegrupper, sammen med ulike proteiner og kolesterol. Lipidenes sammensetning og struktur spiller en avgjørende rolle i reguleringen av biologisk funksjon, inkludert interaksjoner mellom celler og cellulær mikromiljøet, som kan inneholde legemidler, biologiske giftstoffer og miljøgifter. I denne studien beskrives metoder for å formulere uni-lipid og multi-lipid støttet og suspendert celle som etterligner lipid-bilayers. Tidligere ble uni-lipid fosfatidylkolin (PC) lipid bilayers samt multi-lipid placental trophoblast-inspirert lipid bilayers utviklet for bruk i å forstå molekylære interaksjoner. Her vil metoder for å oppnå begge typer bilayermodeller bli presentert. For celler som etterligner multi-lipid bilayers, bestemmes ønsket lipidsammensetning først via lipidekstraksjon fra primære celler eller cellelinjer etterfulgt av flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). Ved hjelp av denne sammensetningen fremstilles lipid vesicles ved hjelp av en tynnfilmhydrerings- og ekstruderingsmetode, og deres hydrodynamiske diameter og zetapotensial er preget. Støttede og suspenderte lipid-bilayers kan deretter dannes ved hjelp av kvartskrystallmikrobalanse med dissipasjonsovervåking (QCM-D) og på en porøs membran for bruk i henholdsvis en parallell kunstig membranpermeabilitetsanalyse (PAMPA). De representative resultatene fremhever reproduserbarhet og allsidighet av in vitro cellemembran lipid bilayer modeller. Metodene som presenteres kan hjelpe til med rask, facile vurdering av interaksjonsmekanismene, som permeasjon, adsorpsjon og innebygging, av ulike molekyler og makromolekyler med cellemembran, som hjelper til med screening av narkotikakandidater og prediksjon av potensiell cellulær toksisitet.

Introduction

Cellemembranen, som hovedsakelig består av fosfolipider, kolesterol og proteiner, er en avgjørende komponent i alle levende celler¹. Med organisering drevet av lipid amfifilitet fungerer cellemembranen som en beskyttende barriere og regulerer hvordan cellen samhandler med omgivelsene². Flere cellulære prosesser er avhengige av lipid- og proteinsammensetningen av membranen^1,2. For eksempel er cellemembraninteraksjoner viktige for effektiv legemiddellevering³. Legemidler, biologer, nanomaterialer, biologiske giftstoffer og miljøgifter kan påvirke integriteten til en cellemembran, og dermed påvirke cellulær funksjon⁴. Konstruksjonen av in vitro-cellemimikeringsmembranmodeller basert på lipidsammensetningen av cellemembraner har potensial til å gi facile verktøy for å forbedre studiet av den potensielle effekten av disse materialene på celler.

Modell lipid bilayers inkluderer lipid vesicles, støttet lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Støttede lipidbilayere er en modell av fosfolipidcellemembranen som vanligvis brukes i bioteknologiske applikasjoner der lipid vesicles brister på et støttet substratmateriale^5,6,7,8,9. En vanlig teknikk som brukes til å overvåke bilayerdannelse er kvartskrystallmikrobalanse med dissipasjonsovervåking (QCM-D), som undersøker adsorpsjon av vesikler i forhold til bulkvæskeegenskapene in situ^{8,10,11,12,13,14} . Tidligere har QCM-D blitt brukt til å demonstrere at under strømningsforhold, når en kritisk vesicle dekning av fosfatidylkolin (PC) lipid vesikler oppnås på overflaten, bryter de spontant inn i stive lipidbilayers¹⁵. Tidligere arbeid har også undersøkt støttet lipidbilayerformasjon med varierende lipidsammensetninger¹⁶, inkorporering av lipidproteiner^17,18,19, og bruk av polymerputer²⁰, noe som gir støttede lipidbilayere som er i stand til å etterligne ulike aspekter av cellemembranfunksjonen.

Lipid bilayers har blitt brukt til å etterligne ulike biologiske barrierer fra sub-cellulære til organnivåer, inkludert mitokondrie, rød blodlegeme og levercellemembraner ved å endre fosfolipid-, kolesterol- og glykolipidkomponentene²¹. Disse mer komplekse multi-lipid vesikler kan kreve flere metoder for å oppnå vesicle brudd, avhengig av lipid sammensetningen. For eksempel har tidligere studier brukt et α-spiralisk (AH) peptid avledet fra hepatitt C-virusets ikke-strukturelle protein 5A for å indusere bilayerdannelse ved å destabilisere adsorbert lipid vesikler^22,23. Ved hjelp av dette AH-peptidet har støttede lipidbilayere som etterligner placentalceller tidligere blitt dannet²⁴. Det store potensialet for støttede lipidbilayers for biomedisinske applikasjoner har blitt demonstrert med undersøkelser som spenner over molekylær og nanopartikkeltransport^25,26, miljøtoksiske interaksjoner²⁷, proteinmontering og funksjon^17,18,19, peptidarrangement og innsetting^28,29, legemiddelscreening³⁰og mikrofluidiske plattformer³¹.

Suspendert lipid bilayers har blitt brukt til farmasøytisk screening studier via en parallell kunstig membran permeabilitet analyse (PAMPA) hvor en lipid bilayer er suspendert over en porøs hydrofob innsats^32,33,34,35. PAMPA lipidmodeller er utviklet for forskjellige biologiske grensesnitt, inkludert blod-hjerne, bukkal, tarm og transdermale grensesnitt³⁶. Ved å kombinere både de støttede lipid-bilayer- og PAMPA-teknikkene, kan adsorpsjon, permeabilitet og innebygging av forbindelser i lipidkomponenter av ønsket vev eller celletype studeres grundig.

Denne protokollen beskriver fabrikasjon og anvendelse av in vitro cellemembran lipid bilayer modeller for å undersøke flere molekylære interaksjoner. Fremstilling av både uni-lipid og multi-lipid støttet og suspendert lipid bilayers er detaljert. For å danne en støttet lipidbilayer utvikles lipid vesikler først ved hjelp av tynnfilmhydrering og ekstruderingsmetoder etterfulgt av fysisk-kjemisk karakterisering. Dannelse av en støttet lipidbilayer ved bruk av QCM-D-overvåking og fabrikasjon av suspenderte lipidmembraner til bruk i PAMPA diskuteres. Til slutt undersøkes multi-lipid vesicles for utvikling av mer komplekse cellemimikeringsmembraner. Ved hjelp av begge typer fremstilte lipidmembraner demonstrerer denne protokollen hvordan dette verktøyet kan brukes til å studere molekylære interaksjoner. Totalt sett konstruerer denne teknikken cellemimikering lipid bilayers med høy reproduserbarhet og allsidighet.

Protocol

1. Utvikling av uni-lipid vesicles Tynnfilmhydreringsmetode Forberedelse og lagring av lipid lagerløsningerMERK: Alle trinn ved bruk av kloroform må utføres i en kjemisk avtrekkshette. Kloroform skal alltid pipetteres ved hjelp av løsemiddelsikre pipettespisser av karbonfiber. Oppløsninger som inneholder kloroform skal alltid oppbevares i hetteglass av glass. Forbered en 10 mg / ml lipidoppløsning ved å legge til riktig volum kloroform i hetteglasset som inneholder lipidpulveret og bl…

Representative Results

Denne protokollen beskriver metoder for å danne støttede og suspenderte lipid-bilayere (figur 1). Det første trinnet for å danne en støttet lipid bilayer er å utvikle lipid vesicles. Mini ekstruderen gjør det mulig å tilberede små mengder lipid vesicles (1 ml eller mindre), mens den store ekstruderen gjør det mulig å fremstille 5-50 ml lipid vesicles i en batch. Størrelsesfordelinger av uni-lipid vesicles dannet av enten mini eller stor ekstruder er vist i fi…

Discussion

Denne protokollen tillater dannelse av lipid vesicles, støttede lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Her presenteres kritiske trinn for å danne hver av disse strukturene. Når du danner lipid vesicles, er det viktig å ekstrudere over overgangstemperaturen til lipid³⁹. Når du er under overgangstemperaturen, er lipiden fysisk til stede i sin bestilte gelfase³⁹. I denne bestilte fasen er hydrokarbon lipidhalene fullt utvidet, noe som gjør ekstrudering utfordrende…

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC)	Avanti Polar Lipids	850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)	Avanti Polar Lipids	840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)	Avanti Polar Lipids	850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)	Avanti Polar Lipids	840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE)	Avanti Polar Lipids	850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))	Avanti Polar Lipids	890703
3 mL Luer-Loc syringes	BD	309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner	Duran Wheaton Kimble	W224605
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004
Alconox	Fisher Scientific	50-821-781
Ammonium formate	Millipore Sigma	LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire	Waters	186002551
Chloroform	Millipore Sigma	LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK	Sarstedt	67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)	Millipore Sigma	36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	LSAC472301
Ethanol	Pharmco	111000200
Filter supports, 10 mm	Avanti Polar Lipids	610014	Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell	Malvern Panalytical	DTS1070
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764-4L
Kimwipes	Kimberly Clark	34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)	Avanti Polar Lipids	840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840051
LiposoFast ® LF-50	Avestin, Inc.
Methanol	Sigma-Aldrich	179337 – 4L
Mini-extruder set with holder/heating block	Avanti Polar Lipids	610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile	Millipore Sigma	MAIPS4510	for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure	TechAir	NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um	Whatman	800309	Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um	Whatman	110605	Size for large extruder
Parafilm	Bemis	PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x	Genesee Scienfitic	25-507X	Dilute to 1x
Qsoft 401 software	Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer	Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL	Duran Wheaton Kimble	986561
Silicon Dioxide, thin QSensors	Biolin Scientific	QSX 303
Sodium chloride (NaCl)	Millipore Sigma	LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-100
Solvent Safe pipette tips	Sigma-Aldrich	S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	860061
Trizma base	Millipore Sigma	LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid	Caisson Labs	TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm	Whatman	230600	Size for large extruder
Zetasizer ZS90	Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software	Malvern Panalytical