Denne artikkelen gir en detaljert metodikk for måling av isolevuglandiner i vev ved immunfluorescens ved bruk av alkalisk fosfatase-konjugert ScFv D11-antistoff. Hypertensjonsmodeller hos både mus og mennesker brukes til å forklare trinnvise prosedyrer og grunnleggende prinsipper knyttet til isolevuglandinmåling i vevsprøver.
Isolevuglandiner (IsoLGs) er svært reaktive gamma ketoaldehyder dannet fra H2-isoprostaner gjennom lipidperoksidasjon og kryssbindende proteiner som fører til betennelse og ulike sykdommer, inkludert hypertensjon. Deteksjon av IsoLG-akkumulering i vev er avgjørende for å kaste lys over deres involvering i sykdomsprosessene. Imidlertid er måling av IsoLG i vev ekstremt vanskelig, og for tiden tilgjengelige verktøy, inkludert massespektrometrianalyse, er arbeidskrevende og ekstremt kostbare. Her beskriver vi en ny metode for in situ påvisning av IsoLG i vev ved bruk av alkalisk fosfatase-konjugert D11 ScFv og et rekombinant-display antistoff produsert i E. coli ved immunfluorescerende mikroskopi. Fire kontroller ble brukt for å validere fargingen: (1) farging med og uten D11, (2) farging med bakterielt periplasmatisk ekstrakt med alkalisk fosfataselinker, (3) irrelevant scFV-antistofffarging og (4) konkurransedyktig kontroll med IsoLG før fargingen. Vi demonstrerer effektiviteten av alkalisk fosfatase-konjugert D11 i både humant og musvev med eller uten hypertensjon. Denne metoden vil trolig tjene som et viktig verktøy for å studere rollen til IsoLG i et bredt spekter av sykdomsprosesser.
Isolevuglandiner (IsoLG), også kjent som isoketaler, er isomerer av 4-ketoaldehydfamilien, som er produkter av lipidperoksydasjon, og reagerer med og addukterer til primære aminer på proteiner 1,2. IsoLG har vært involvert i flere sykdommer, inkludert kardiovaskulær, Alzheimers, lunge- og leversykdommer, og mange typer kreft3. IsoLG har blitt mest omfattende studert i deres bidrag til kardiovaskulær sykdom (CVD), som er en betydelig helsemessig og økonomisk byrde globalt, inkludert USA. Det er anslått at 92.1 millioner amerikanske voksne har minst en type CVD, med 2030 estimerte anslag som når til 43.9% av den amerikanske voksne befolkningen4. Senking av blodtrykk, kolesterol og røykeslutt reduserer den totale risikoen og forekomsten av CVD-hendelser5.
Høyt blodtrykk eller hypertensjon er en viktig risikofaktor for kardiovaskulær sykdom og påvirker omtrent halvparten av den amerikanske befolkningen6. Tidligere studier har funnet at betennelse er en underliggende årsak til hypertensjon, og at IsoLG spiller en rolle7. Hypertensive stimuli, inkludert angiotensin II, katekolaminer, aldosteron og overflødig diettsalt, induserer IsoLG-akkumulering i antigenpresenterende celler, inkludert dendrittiske celler (DC), som igjen aktiverer T-celler for å proliferere og produsere inflammatoriske cytokiner som bidrar til hypertensjon 8,9.
Tidligere har IsoLG blitt målt med immunhistokjemi, massespektrometri, enzymbundet immunosorbentanalyse og flowcytometri10,11. For å lette måling av IsoLG ble det utviklet et enkeltkjede fragmentvariabel (scfv) rekombinant antistoff (D11) mot IsoLG12. I utgangspunktet inneholdt dette D11-antistoffet en 11 aminosyre E-tag og krevde et sekundært antistoff for immunhistokjemi deteksjon11. Det var imidlertid vanskelig å finne et pålitelig sekundært antistoff mot E-taggen etter at produksjonen ble avsluttet av produsenten. Derfor har vi utviklet en pålitelig protokoll for immunfluorescerende farging av IsoLG ved bruk av D11 konjugert med alkalisk fosfatase (D11-AP), som vi har demonstrert i mus og humant vev med og uten hypertensjon.
D11 har blitt brukt mye for å oppdage IsoLG-addukterte proteiner i celler eller vev som en markør for betennelse eller oksidativt stress ved sykdom 8,9,20. Tidligere inneholdt D11 en E-tag og IHC-utvikling krevde bruk av et sekundært anti-E tag antistoff konjugert med HRP10,20,21. Her har vi utviklet og optimalisert protokoll for påvisning av IsoLG-addukterte proteiner ved bruk av D11-antistoffet konjugert med alkalisk fosfatase i stedet for E-tag, noe som eliminerer behovet for en sekundær antistoffinkubasjon.
For å bestemme spesifisiteten til D11-AP ble det utført fire negative kontrolleksperimenter. Vi utførte protokollen uten tilstedeværelse av D11 og hadde minimal utvikling. Disse resultatene har en todelt indikasjon: endogen alkalisk fosfatase bidrar ikke til utvikling, og den observerte fargingen skyldes D11 og ikke en annen medvirkende faktor. Deretter farget vi lysbilder med AP-linkeren uten D11. Dette eksperimentet resulterte i lite farging, noe som indikerer at fri AP eller andre faktorer i det periplasmatiske ekstraktet ikke forårsaker flekken vi observerer i nærvær av D11. For å sikre spesifisiteten til D11 til IsoLG, preinkuberte vi D11-AP med renset IsoLG før farging av lysbilder. Vi så en nedgang i utviklingen som indikerer at D11-AP var bundet til IsoLG-proteinet, og dermed utmattet mengden fri D11-AP for å binde seg til IsoLG tilstede i vevet. Til slutt, for å sikre at D11-AP var bindende til IsoLG og ikke MSA-proteinet IsoLG var bundet til, preinkuberte vi D11-AP kun med MSA. Det var ingen endringer i utviklingen, noe som indikerer at D11-AP ikke var bindende til MSA, men IsoLG-proteinet. Til slutt var forskere som utviklet fargeprotokollen blinde for hypertensiv status for humant tarmvev. Forskjellene i farging observert mellom pasienter med hypertensjon og pasienter med normotension skyldtes ikke skjevhet og er tidligere beskrevet22,23.
Selv om vår protokoll for påvisning av IsoLG-addukterte proteiner ved bruk av D11-antistoffet konjugert med alkalisk fosfatase i stedet for E-tag er streng og robust og eliminerer behovet for en sekundær antistoffinkubasjon, har den noen begrensninger. En begrensning er at vi brukte D11 konjugert med alkalisk fosfatase i det periplasmatiske ekstraktet, og det kan være falsk farging av endogen alkalisk fosfatase i det periplasmatiske ekstraktet eller visse vev, som tarm24. Imidlertid inkluderte det første trinnet for å utvikle denne protokollen å deaktivere endogen alkalisk fosfatase som kan være tilstede i vev25. I utgangspunktet ble kaldeddiksyre, BMW og Levamisol26 testet for effektivitet. Ingen av disse reduserte fullstendig tilstedeværelsen av aktiv endogen alkalisk fosfatase. Varme har blitt brukt til å deaktivere alkalisk fosfatase27, så vi testet varmedeaktivering av alkalisk fosfatase i forskjellige buffere. Vi fant varmemonterte og hydrerte lysbilder i sitratbuffer eliminert mest endogent alkalisk fosfatase. Slides ble opprinnelig utviklet ved hjelp av et kjemiluminescerende / fluorescerende substrat, men når det ble avbildet uten dette substratet, var det en høy mengde autofluorescens. VectorRed er et substrat som utvikles i nærvær av alkalisk fosfatase for å produsere et kromogen som kan visualiseres i Texas Red / TRITC kanalområdet. Ved hjelp av dette substratet kunne vi lettere observere signal over bakgrunnsautofluorescens. Forsiktighet bør utvises under fargeprosessen for å minimere kunstig farging. Tørking av vev på skred etter hydrering inntil avbildning har resultert i økt utvikling. D11-AP skal alisiteres og oppbevares ved -20 °C. Flere fryse-tine-sykluser bør unngås ved arbeid med D11-AP. Fosfatbufret saltvann (PBS) kan også påvirke den enzymatiske aktiviteten til alkalisk fosfatase og bør ikke brukes som vaskebuffer28. Som med enhver antistoffbasert tilnærming, må grundig testing og optimalisering utføres for å sikre at fargingen er spesifikk, og at signalet ikke er over eller under forsterket.
Avslutningsvis har vi utviklet en kraftig, streng og robust optimalisert protokoll for å oppdage IsoLG-addukterte proteiner ved bruk av D11-antistoffet konjugert med alkalisk fosfatase i stedet for E-tag. Denne protokollen gir flere fordeler: For det første er det billigere å bruke D11 som et alkalisk fosfatasefusjonsprotein. D11 ble opprinnelig avledet fra et fagantistoffbibliotek som ikke kunne kommersialiseres og var dyrt å rense. Selv om D11 i E. coli periplasmatisk ekstrakt kunne gi et billig alternativ, var det ineffektivt i de fleste analyser. For det andre tillater alkalisk fosfatasefusjonstilnærming D11 scfv å ha en nyttig reporter15 (alkalisk fosfatase) smeltet til den og trenger ikke å bli renset for bruk i immunoassays da substrater er kommersielt tilgjengelige. For det tredje danner E. coli alkalisk fosfatase dimerer29. Så D11, når smeltet til alkalisk fosfatase, vil også danne dimerer, og dette øker antistoffets aviditet og bindingsaktivitet30. Endelig kan D11 konjugert med alkalisk fosfatase i periplasmatisk ekstrakt enkelt rengjøres ved hjelp av Cibacron Blue Sepharose. D11 har et høyt isoelektrisk punkt (~9,2 pH). Som sådan er den positivt ladet og kan binde seg til Cibacron Blue gjennom pi-kation-interaksjoner. De fleste urenheter i E. coli periplasmatisk ekstrakt kan elueres av harpiksen. D11 konjugert med alkalisk fosfatase kan deretter elueres ved bruk av høyt salt (~ 1.5M NaCl) i vann. Den eluerte D11 konjugert med alkalisk fosfatase er ganske stabil ved 4-8 ° C i den høye saltoppløsningen. Dermed har vi utviklet en protokoll som ikke bare gjør D11-antistoffet tilgjengelig til en lav kostnad, men eliminerer også de ekstra trinnene og behovet for sekundær antistoffinkubasjon. Denne protokollen muliggjør reproduserbar måling av IsoLG, som akkumuleres i vev i flere sykdommer der økt oksidativt stress spiller en rolle.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 og R03HL155041 til A.K. Vi takker Digital Histology Shared Resource – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 for visualisering og lysbildeskanning.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |