Denna artikel ger en detaljerad metod för mätning av isolevuglandiner i vävnader genom immunofluorescens med användning av alkalisk fosfataskonjugerad ScFv D11-antikropp. Hypertonimodeller hos både möss och människor används för att förklara steg-för-steg-procedurer och grundläggande principer associerade med isolevuglandinmätning i vävnadsprover.
Isolevuglandiner (IsoLGs) är mycket reaktiva gammaketoaldehyder bildade från H2-isoprostaner genom lipidperoxidation och tvärbindningsproteiner som leder till inflammation och olika sjukdomar inklusive högt blodtryck. Detektion av IsoLG-ackumulering i vävnader är avgörande för att belysa deras engagemang i sjukdomsprocesserna. Mätning av IsoLGs i vävnader är dock extremt svårt, och för närvarande tillgängliga verktyg, inklusive masspektrometrianalys, är mödosamma och extremt dyra. Här beskrivs en ny metod för in situ-detektion av IsoLGs i vävnader med användning av alkaliskt fosfataskonjugerat D11 ScFv och en rekombinant fagdisplayantikropp producerad i E. coli genom immunofluorescerande mikroskopi. Fyra kontroller användes för att validera färgningen: (1) färgning med och utan D11, (2) färgning med bakteriellt periplasmatiskt extrakt med alkalisk fosfataslänkare, (3) irrelevant scFV-antikroppsfärgning och (4) konkurrenskontroll med IsoLG före färgningen. Vi demonstrerar effektiviteten av den alkaliska fosfataskonjugerade D11 i både humana och musvävnader med eller utan hypertoni. Denna metod kommer sannolikt att fungera som ett viktigt verktyg för att studera rollen av IsoLGs i en mängd olika sjukdomsprocesser.
Isolevuglandiner (IsoLG), även kända som isoketaler, är isomerer av 4-ketoaldehydfamiljen, som är produkter av lipidperoxidation, och reagerar med och addukterar till primära aminer på proteiner 1,2. IsoLGs har varit inblandade i flera sjukdomar, inklusive kardiovaskulära, Alzheimers, lung- och leversjukdomar och många typer av cancer3. IsoLGs har studerats mest omfattande i deras bidrag till hjärt-kärlsjukdom (CVD), vilket är en betydande hälso- och ekonomisk börda globalt, inklusive USA. Det uppskattas att 92.1 miljoner amerikanska vuxna har minst en typ av CVD, med 2030 uppskattade prognoser som når 43.9% av den amerikanska vuxna befolkningen4. Att sänka blodtryck, kolesterol och rökavvänjning minskar den totala risken och förekomsten av CVD-händelser5.
Högt blodtryck eller högt blodtryck är en viktig riskfaktor för hjärt-kärlsjukdom och drabbar ungefär hälften av den amerikanska befolkningen6. Tidigare studier har visat att inflammation är en bakomliggande orsak till högt blodtryck och att IsoLGs spelar en roll7. Hypertensiva stimuli, inklusive angiotensin II, katekolaminer, aldosteron och överskott av dietsalt, inducerar IsoLG-ackumulering i antigenpresenterande celler inklusive dendritiska celler (DC), som i sin tur aktiverar T-celler att proliferera och producera inflammatoriska cytokiner som bidrar till hypertoni 8,9.
Tidigare har IsoLGs mätts med immunhistokemi, masspektrometri, enzymkopplad immunosorbentanalys och flödescytometri10,11. För att underlätta mätningen av IsoLGs utvecklades en single-chain fragment variable (scfv) rekombinant antikropp (D11) mot IsoLGs12. Ursprungligen innehöll denna D11-antikropp en 11 aminosyra E-tag och krävde en sekundär antikropp för immunohistokemidetektion11. Det var dock svårt att hitta en tillförlitlig sekundär antikropp mot E-tag efter att tillverkaren avbröt sin produktion. Därför har vi utvecklat ett tillförlitligt protokoll för immunofluorescerande färgning av IsoLGs med D11 konjugerat med alkaliskt fosfatas (D11-AP), vilket vi har visat i mus- och humanvävnader med och utan hypertoni.
D11 har använts i stor utsträckning för att detektera IsoLG-addukterade proteiner i celler eller vävnader som markör för inflammation eller oxidativ stress vid sjukdom 8,9,20. Tidigare innehöll D11 en E-tagg och IHC-utveckling krävde användning av en sekundär anti-E-taggantikropp konjugerad med HRP10,20,21. Här har vi utvecklat och optimerat protokoll för detektion av IsoLG-addukterade proteiner med hjälp av D11-antikroppen konjugerad med alkaliskt fosfatas i stället för E-tag, vilket eliminerar behovet av en sekundär antikroppsinkubation.
För att bestämma specificiteten hos D11-AP utfördes fyra negativa kontrollexperiment. Vi utförde protokollet utan närvaro av D11 och hade minimal utveckling. Dessa resultat har en tvåfaldig indikation: endogent alkaliskt fosfatas bidrar inte till utvecklingen, och den observerade färgningen beror på D11 och inte en annan bidragande faktor. Därefter färgade vi bilder med AP-länkaren utan D11. Detta experiment resulterade i liten färgning, vilket indikerar fri AP eller andra faktorer i det periplasmatiska extraktet orsakar inte fläcken vi observerar i närvaro av D11. För att säkerställa specificiteten av D11 till IsoLG förinkuberade vi D11-AP med renad IsoLG innan vi färgade bilder. Vi såg en minskning av utvecklingen vilket indikerar att D11-AP var bunden till IsoLG-protein, vilket uttömde mängden fri D11-AP för att binda till IsoLG närvarande i vävnaden. Slutligen, för att säkerställa att D11-AP var bindande till IsoLG och inte MSA-proteinet som IsoLG var bundet till, förinkuberade vi D11-AP endast med MSA. Det fanns inga förändringar i utvecklingen, vilket indikerar att D11-AP inte var bindande till MSA utan IsoLG-proteinet. Slutligen var forskare som utvecklade färgningsprotokollet blinda för hypertensiv status hos mänsklig tarmvävnad. Skillnaderna i färgning som observerades mellan patienter med hypertoni och patienter med normotension berodde inte på bias och har tidigare beskrivits22,23.
Även om vårt protokoll för detektion av IsoLG-addukterade proteiner med användning av D11-antikroppen konjugerad med alkaliskt fosfatas i stället för E-tag är rigorös och robust och eliminerar behovet av en sekundär antikroppsinkubation, har det vissa begränsningar. En begränsning är att vi använde D11 konjugerat med alkaliskt fosfatas i det periplasmatiska extraktet, och det kan finnas falsk färgning av endogent alkaliskt fosfatas i periplasmatiskt extrakt eller vissa vävnader, såsom tarm24. Det första steget för att utveckla detta protokoll inkluderade emellertid att inaktivera endogent alkaliskt fosfatas som kan vara närvarande i vävnader25. Inledningsvis testades kall ättiksyra, BME och Levamisol26 för effektivitet. Ingen av dessa minskade helt närvaron av aktivt endogent alkaliskt fosfatas. Värme har använts för att inaktivera alkaliskt fosfatas27, så vi testade värmedeaktivering av alkaliskt fosfatas i olika buffertar. Vi fann att värmemonterade och hydratiserade glas i citratbuffert eliminerade mest endogent alkaliskt fosfatas. Slides utvecklades ursprungligen med hjälp av ett kemiluminescerande / fluorescerande substrat, men när de avbildades utan detta substrat fanns det en hög mängd autofluorescens. VectorRed är ett substrat som utvecklas i närvaro av alkaliskt fosfatas för att producera en kromogen som kan visualiseras i Texas Red / TRITC-kanalområdet. Med hjälp av detta substrat kunde vi lättare observera signalen ovanför bakgrundsautofluorescens. Försiktighet bör vidtas under färgningsprocessen för att minimera artefaktisk färgning. Torkning av vävnader på objektglas efter hydrering tills avbildning har resulterat i ökad utveckling. D11-AP bör alikvoteras och lagras vid -20 °C. Flera frys-tina cykler bör undvikas vid arbete med D11-AP. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kan också påverka den enzymatiska aktiviteten hos alkaliskt fosfatas och bör inte användas som tvättbuffert28. Som med alla antikroppsbaserade tillvägagångssätt måste grundlig testning och optimering utföras för att säkerställa att färgningen är specifik och att signalen inte är över eller under förstärkt.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett kraftfullt, rigoröst och robust optimerat protokoll för att detektera IsoLG-addukterade proteiner med användning av D11-antikroppen konjugerad med alkaliskt fosfatas i stället för E-tag. Detta protokoll ger flera fördelar: För det första är det billigare att använda D11 som ett alkaliskt fosfatasfusionsprotein. D11 härrörde ursprungligen från ett fagantikroppsbibliotek som inte kunde kommersialiseras och var dyrt att rena. Även om D11 i E. coli periplasmatiskt extrakt kunde ge ett billigt alternativ, var det ineffektivt i de flesta analyser. För det andra tillåter den alkaliska fosfatasfusionsmetoden D11 scfv att ha en användbar reporter15 (alkaliskt fosfatas) smält till den och skulle inte behöva renas för användning i immunanalyser eftersom substrat är kommersiellt tillgängliga. För det tredje bildar E. coli alkaliskt fosfatas dimerer29. Så D11, när det smälts till det alkaliska fosfataset, skulle också bilda dimerer och detta ökar antikroppens aviditet och bindningsaktivitet30. Slutligen kan D11 konjugerad med alkaliskt fosfatas i periplasmatiskt extrakt enkelt rengöras med Cibacron Blue Sepharose. D11 har en hög isoelektrisk punkt (~ 9,2 pH). Som sådan är den positivt laddad och kan binda till Cibacron Blue genom pi-katjoninteraktioner. De flesta föroreningarna i E. coli periplasmatiskt extrakt kan elueras av hartset. D11 konjugerad med alkaliskt fosfatas kan sedan elueras med högt salt (~ 1,5M NaCl) i vatten. Den eluerade D11 konjugerad med alkaliskt fosfatas är ganska stabil vid 4-8 °C i högsaltlösningen. Således har vi utvecklat ett protokoll som inte bara gör D11-antikroppen tillgänglig till en låg kostnad, utan också eliminerar de extra stegen och behovet av sekundär antikroppsinkubation. Detta protokoll underlättar reproducerbar mätning av IsoLG, som ackumuleras i vävnader vid flera sjukdomar där ökad oxidativ stress spelar en roll.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 och R03HL155041 till A.K. Vi tackar Digital Histology Shared Resource – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 för visualisering och bildskanning.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |