Vi tilbyr en protokoll for vurdering av motorisk oppførsel via et atferdstestbatteri hos rotter etter isjias nerveknusingsskade.
Induksjonen av en perifer nerveskade er en mye brukt metode i nevrovitenskap for vurdering av blant annet reparasjons- og smertemekanismer. I tillegg, innen bevegelsesforstyrrelser, har isjiasknusingsskade blitt brukt til å utløse en dystonilignende fenotype i genetisk disponerte DYT-TOR1A gnagermodeller av dystoni. For å oppnå konsistente, reproduserbare og sammenlignbare resultater etter en isjias nerveknusingsskade, er en standardisert metode for å indusere nerveknusingen viktig, i tillegg til en standardisert fenotypisk karakterisering. Det må ikke bare tas hensyn til det spesifikke sortimentet av atferdstester, men også til de tekniske kravene, riktig utførelse og påfølgende dataanalyse. Denne protokollen beskriver i detalj hvordan du utfører en isjias nerveknusingsskade og gir et atferdsmessig testbatteri for vurdering av motorunderskudd hos rotter som inkluderer den åpne felttesten, CatWalk XT-ganganalysen, strålevandringsoppgaven og stigen rung walking task.
Gnagere er gode modellorganismer for å utdype forståelsen av menneskelige sykdommer1,2 ved å teste hypoteser på flere biologiske nivåer. Et grunnleggende biologisk nivå for karakterisering av gnagermodeller er fenotypenivået, målt ved atferdsmessige vurderinger. Avhengig av dyremodellen og det vitenskapelige forskningsspørsmålet, er valg av et kraftig og pålitelig atferdstestbatteri viktig for å dekke et bredt spekter av atferdsaspekter som for dyremodeller av Parkinsons sykdom og dystoni3,4,5,6.
Isjiasnerven er den største nerven i menneskekroppen med motor så vel som sensoriske fibre. Skader på isjiasnerven kan lett skyldes en rekke hendelser som trafikkulykker og operasjoner7,8. Derfor er forskningsaktiviteter som bruker gnagermodeller med isjiasnerveskader, av translasjonsmessig relevant verdi. Selv om det translasjonelle aspektet av nerveregenerering fra rotte til menneske må betraktes som kritisk9, er isjias nerveknusingsskaden (axonotmesis) i gnagermodeller en vanlig brukt metode for å analysere degenerasjons- og regenereringsprosesser for perifere nerver10,11. Ved en knuseskade er nerven ikke fullstendig transektert. Det skader axonen, noe som resulterer i ledningsblokk direkte etter knuseskade etterfulgt av regenerative prosesser 4,12,13.
Videre, i dystoni forskning, er den ensidige isjias nerveknusingsskaden en etablert metode for å utløse dystonilignende bevegelser (DLM) i genetisk disponerte dystoni gnagermodeller, som ikke viser DLM perse 4,14. Det antas at perifere nervetraumer forstyrrer den sensoriske integrasjonen ved å påvirke isjiasnervefibrene, som er ansvarlige for motoriske og sensoriske funksjoner15.
Vi gir her en detaljert beskrivelse for en standardisert knuseskade av isjiasnerven og et batteri av motoriske atferdsvurderinger som består av open field test (OFT), CatWalk XT ganganalyse, strålevandringsoppgave og stigeløpende oppgave i naiv vill type (wt) rotter (n = 8-9) og wt rotter fem uker etter ensidig isjias nerveknusing skade (n = 10). OFT gir informasjon om den generelle lokomotoriske aktiviteten, mens en detaljert ganganalyse oppnås av det automatiserte ganganalysesystemet CatWalk XT. Strålevandringsoppgaven brukes til å vurdere motorkoordineringen ved å evaluere tiden for å krysse bjelken og antall fotplasseringsfeil. For gangytelsesanalyse gir stigeløpoppgaven informasjon om plassering av fot eller pote og feil på et horisontalt stigeløpsapparat med et konstant, men uregelmessig rungmønster.
Denne atferdsmessige vurderingsprotokollen gir en oversikt over fordeler og ulemper, samt mulige avlesninger av det valgte atferdstestbatteriet i en gnagermodell etter isjias nerveknusingsskade.
For å oppnå et komparativt utfall av isjias nerveknusingsskaden, er en konsekvent knuseteknikk obligatorisk. Bruk av en ikke-serrated klemme (Ultra Fine Hemostat) i stedet for tang kan forbedre konsistensen av forelskelsen. Bruk samme klemme så vel som samme knuseposisjon for å garantere lik nervekompresjon. Den eksklusive bruken av klemmen for knuseskade og håndtering av klemmen med forsiktighet forbedrer konsistensen. Utfør også prosedyren for forelskelsesskaden med forsiktighet. Ytterligere skade på nerven under operasjonen som uønsket trekkraft av nerven kan føre til uønskede bivirkninger som automutilation. Derfor anbefales en forsiktig nerveforberedelse samt administrering av en smertestillende i minst to dager.
Multifaktoriell vurdering av motorisk oppførsel kan karakterisere fenotypen etter nerveknusingsskade hos rotter på ulike nivåer. Vi brukte OFT, CatWalk XT ganganalyse, strålevandringsoppgave og stigeløpsoppgave. En blindet eksperimentell prosedyre og dataanalyse til eksperimentelle grupper er avgjørende for disse eksperimentene. Før atferdsvurdering ble dyr akklimatiserte i testrommet under testforhold i minst 30 minutter. Alle atferdstestene som brukes her, har fordelen at mat eller vannmangel ikke er nødvendig. Det samme gruppesettet med dyr ble brukt i alle beskrevne atferdstester. Maksimalt to forskjellige atferdstester per dag ble utført for hvert dyr. Hvis atferdstester utføres med jevne mellomrom, vær oppmerksom på en sammenlignbar prosedyre, som å utføre testen i samme dyrerekkefølge og samtidig på dagen. Et ytterligere viktig aspekt for atferdsanalyse er rotters dag-natt syklus. Vurder en omvendt dag-natt syklus for å oppnå mer naturlige og høyere nivåer av aktivitet på dagsyklusen (mørk syklus). Dette må vurderes spesielt for måling av spontan oppførsel, som OFT. I dette eksperimentet kunne ikke en omvendt dag-natt syklus implementeres, men en tilstrekkelig akklimatisering til testforholdene ble sikret. En perfekt belysning er avgjørende for høyoppløselige videoer for strålevandringsoppgaven og stigen rung walking oppgave. Denne høye videokvaliteten kan ikke nås når du utfører eksperimenter i mørket.
Vurderingen av gang krever en kontinuerlig oppgaveytelse. Det første viktige aspektet ved en kontinuerlig oppgaveytelse er å overbevise dyrene om å krysse oppsettet. For å øke motivasjonen, plasser små matpellets (45 mg) på slutten av oppsettet. For at dyr skal bli kjent med matpellets, bør pelletsene mates til dem før testing. Det kan også være nyttig med en målboks på slutten av oppsettet. Oppsettet av CatWalk inkluderer allerede en målboks, men rotter nøler noen ganger med å gå inn i målboksen. Alternativt kan du legge til et lite bur i målboksen, men hjemmeburet fra rotter passer ikke inn i målboksen. La rotten habituate i buret i noen minutter før oppkjøpet. I tillegg kan en annen rotte fra samme hjemmebur plasseres i målboksen eller inn i buret inne i målboksen. Pass på at den andre rotten forblir i esken og ikke blokkerer inngangen til målboksen. Videre er det også mulig å fjerne målboksen fra CatWalk-systemet og plassere rottehjemburet på slutten av gangveien, noe som gjør at rotten kan komme inn i sitt “hjemmeområde” etter hvert løp. For oppsett av strålevandringsoppgaven og stigen rung walking oppgave, anbefaler vi å legge til en målboks eller hjemmeburet på slutten av oppsettet. For å sikre konsistens, bør CatWalk, strålevandringsoppgaven og stigen rung walking oppgave utføres minst en gang i uken med seks til ti løp.
Selv om ikke alle analyser ga signifikante forskjeller i denne studien, bør du vurdere at en inkludering av genmodifiserte dyr eller behandlingsgrupper kan produsere verdifulle data som kan skille mellom grupper fra de samme atferdstestene.
Nerveknusingsskaden hadde ingen effekt på rottens lokomotoriske aktivitet, som ble målt i en fem minutters OFT. Catwalk XT ganganalyse er et mer objektivt og følsomt verktøy for å analysere gang-, pote- og tåplassering. Etter en intensiv trening lærer rottene å krysse gangveien til CatWalk XT-apparatet til standardinnstillingene. Nerveskaden reduserer ikke rottens evne til å krysse gangveien. Den automatiske beregningen av ulike parametere presenterer dataene objektivt. Ytterligere informasjon kan oppnås ved å bruke modulen “Interactive Footprint Measurements”, og disse analysene ga faktisk betydelige forskjeller i ulike parametere for tåspredning, utskriftslengde og potevinkel med kroppsakse som sammenlignet rotter med og uten nerveskade.
Rotter kan enkelt trenes for strålevandringsoppgaven. Forskjeller i latenstiden for å krysse strålen og i antall fotslipper per trinn i det nerveskarpede bakbenet ble oppdaget ved å sammenligne naiv med knuse-skadede rotter. En ulempe med å analysere nervesårne rotter med strålevandringsoppgaven er størrelsen på strålen. I løpet av de to første ukene etter isjiasnervekningsskaden trenger rottene hjelp til å krysse strålen da balansen er svekket. Selv om noen rotter kan være i stand til å krysse bjelken, er risikoen for skader forårsaket av et fall høy. Nerveknuste dyr bør derfor assisteres til å krysse strålen de første to ukene etter isjias nerveknusingsskade eller lenger, om nødvendig. Det er imidlertid vanskelig å sammenligne løp med og uten hjelp. Motorbalansen er også en viktig parameter vurdert av strålevandringsoppgaven. Vi anså denne parameteren for ikke å være relevant for vår nerveknusing rotte modell. Derfor kunne ikke score beskrevet av Ohwatashi et al. og Johansson &Ohlsson brukes, og løp med ufullstendig stråletravers ble utelukket for dataanalyse18,19.
Skalaen i 7-kategorien fra Metz et al. kan analysere både for- og bakben og skille mellom forskjellige alvorlighetsgrader av feil i alle lemmer under stigen rung walking oppgave16,17. Ved å analysere de mest fremtredende feilene, som inkluderer kategoriene fra 0 til 2, kan det ikke oppdages noen forskjeller i feil per trinn i bakbenet når man sammenligner nerveskarde wt rotter med naive wt rotter. Videre var ventetiden for å krysse stigeløpsapparatet ikke forskjellig mellom nervesårne wt rotter og wt naive rotter. Dyplæringsmodeller kan forbedre og fremskynde dataanalyse av stigen rung walking oppgave gjennom en automatisert tilnærming.
Det er viktig å nevne at nerveknusingsskaden så vel som alle beskrevne atferdstester lett kan oversettes til mus, ved å tilpasse innstillingene og størrelsene på oppsettene. Bruken av mus som modellorganisme har den gunstige effekten som transgene modeller for mange menneskelige sykdommer eksisterer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF DysTract til C.W.I.) og av Det tverrfaglige senter for klinisk forskning (IZKF) ved Universitetet i Würzburg (N-362 til C.W.I.; Z2-CSP3 til L.R.). I tillegg har dette prosjektet fått støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover til J.V.), og fra VERUM Foundation. Videre er C.W.I. finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Reseach Foundation) Project-ID 424778381-TRR 295, av Deutsche Stiftung Neurologie og ParkinsonFonds. L.R. støttes i tillegg av Dystonia Medical Reseach Foundation.
Forfatterne takker Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel og Louisa Frieß for deres tekniske assistanse samt Helga Brünner for dyrepleien.
Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
Beam | self made | ||
Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
Box for OFT | self made | ||
Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Dumont #2 – laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
Heating table | MEDAX | 13801 | |
Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
Kinovea | www.kinovea.org | ||
Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
Octeniderm | Schülke | 118211 | |
Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
Rubber band retractors | self made | ||
Spacer for beam | self made | ||
Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |