Vi tillhandahåller ett protokoll för bedömning av motoriskt beteende via ett beteendetestbatteri hos råttor efter ischias nervkross skada.
Induktion av en perifer nerv skada är en allmänt använd metod i neurovetenskap för bedömning av reparation och smärta mekanismer bland andra. Inom forskningsområdet rörelsestörningar har dessutom ischiaskrossskada använts för att utlösa en dystoniliknande fenotyp i genetiskt predisponerade DYT-TOR1A-gnagarmodeller av dystoni. För att uppnå konsekventa, reproducerbara och jämförbara resultat efter en ischias nerv crush skada, är en standardiserad metod för att inducera nerv crush viktigt, utöver en standardiserad fenotypisk karakterisering. Uppmärksamhet måste ägnas inte bara åt det specifika sortimentet av beteendetester, utan också till de tekniska kraven, korrekt körning och på varandra följande dataanalys. Detta protokoll beskriver i detalj hur man utför en ischias nervkross skada och ger ett beteendetestbatteri för bedömning av motoriska underskott hos råttor som inkluderar det öppna fälttestet, CatWalk XT gånganalys, strålgångsuppgiften och stegen rung gånguppgift.
Gnagare är utmärkta modellorganismer för att fördjupa förståelsen av mänskligasjukdomar 1,2 genom att testa hypoteser på flera biologiska nivåer. En grundläggande biologisk nivå för karakterisering av gnagare modeller är fenotyp nivå, mätt genom beteendemässiga bedömningar. Beroende på djurmodellen och den vetenskapliga forskningsfrågan är valet av ett kraftfullt och pålitligt beteendetestbatteri viktigt för att täcka ett brett spektrum av beteendeaspekter som för djurmodeller av Parkinsons sjukdom och dystoni3,4,5,6.
Ischiasnerven är den största nerven i människokroppen med motoriska såväl som sensoriska fibrer. Skador på ischiasnerven kan lätt uppstå från en mängd olika händelser som trafikolyckor och operationer7,8. Därför är forskningsaktiviteter med hjälp av gnagaremodeller med ischiasnervskador av translationellt relevant värde. Även om den translationella aspekten av nervregenerering från råtta till människa måste betraktas kritiskt9, är ischiasnervens krossskada (axonotmesis) i gnagaremodeller en vanlig metod för att analysera degeneration och regenereringsprocesser av perifera nerver10,11. Vid en krossskada är nerven inte helt transected. Det skadar axonen, vilket resulterar i ledningsblock direkt efter krossskada följt av regenerativa processer 4,12,13.
Dessutom, i dystoni forskning, är den ensidiga ischias nerv crush skada en etablerad metod för att utlösa dystoni-liknande rörelser (DLM) i genetiskt predisponerade dystoni gnagare modeller, som inte visar DLM i sig4,14. Det antas att perifera nerv trauma stör sensorimotor integration genom att påverka ischias nervfibrer, som är ansvariga för motoriska och sensoriska funktioner15.
Vi ger här en detaljerad beskrivning för en standardiserad kross skada av ischias nerv och ett batteri av motoriska beteende bedömningar som består av öppna fältet test (OFT), CatWalk XT gånganalys, balk gång uppgift och stege rung gång uppgift i naiva vilda typ (wt) råttor (n= 8-9) och wt råttor fem veckor efter ensidiga ischias nerv crush skada (n = 10). OFT ger information om den allmänna lokomotoriska aktiviteten, medan en detaljerad gånganalys uppnås av det automatiserade gånganalyssystemet CatWalk XT. Strålgångsuppgiften används för att bedöma motorkoordinering genom att utvärdera tiden för att korsa balken och antalet fotplaceringsfel. För gångprestandaanalys ger stege rung gånguppgift information om fot- eller tassplacering och fel på en horisontell stege rungapparatur med ett konstant men oregelbundet rungmönster.
Detta beteendemässiga bedömningsprotokoll ger en översikt över fördelar och nackdelar samt möjliga avläsningar av det valda beteendetestbatteriet i en gnagaremodell efter ischiasnervkrossskada.
För att få ett jämförande resultat av ischiasnervens krossskada är en konsekvent krossteknik obligatorisk. Användningen av en icke-räffad klämma (Ultra Fine Hemostat) istället för tång kan förbättra krossens konsistens. Använd samma klämma samt samma krossposition för att garantera lika nervkompression. Exklusiv användning av klämman för krossskada och hantering av klämman med försiktighet förbättrar konsistensen. Utför också proceduren för krossskadan med försiktighet. Ytterligare skador på nerven under kirurgi såsom oönskad dragkraft i nerven kan leda till oönskade biverkningar som automutilation. Därför rekommenderas en noggrann nerv förberedelse samt en administrering av en smärtstillande medel i minst två dagar.
Multifaktoriell bedömning av motoriskt beteende kan karakterisera fenotypen efter nervkrossskada hos råttor på olika nivåer. Vi använde OFT, CatWalk XT gånganalys, balk gånguppgift och stege rung gånguppgift. Ett förblindat experimentellt förfarande och dataanalys för experimentella grupper är avgörande för dessa experiment. Före beteendebedömning acklimatiserades djuren i testrummet under testförhållanden i minst 30 minuter. Alla beteendetester som tillämpas häri har fördelen att mat- eller vattenbrist inte krävs. Samma grupp av djur användes i alla beskrivna beteendetester. Högst två olika beteendetester per dag utfördes för varje djur. Om beteendetester utförs med jämna mellanrum, var uppmärksam på ett jämförbart förfarande, som att utföra testet i samma djurordning och vid samma tid på dagen. En annan viktig aspekt för beteendeanalys är råttornas dag-natt-cykel. Överväg en omvänd dag-natt cykel för att få mer naturliga och högre nivåer av aktivitet vid dagcykeln (mörk cykel). Detta måste övervägas speciellt för mätning av spontant beteende, som OFT. I detta experiment kunde en omvänd dag-natt cykel inte genomföras, men en adekvat acklimatisering till test villkoren säkerställdes. En perfekt belysning är avgörande för högupplösta videor för strålvandringsuppgiften och stege rung gånguppgiften. Denna höga videokvalitet kan inte nås när du utför experiment i mörkret.
Bedömningen av gång kräver en kontinuerlig uppgift prestanda. Den första viktiga aspekten av en kontinuerlig uppgiftsprestanda är att övertyga djuren att korsa installationen. För att öka motivationen, placera små matpellets (45 mg) i slutet av installationen. För att djuren ska bekanta sig med matpelletsen bör pelletsen matas till dem före testning. Dessutom kan en målruta i slutet av installationen vara till hjälp. Installationen av CatWalk innehåller redan en mållåda, men råttor tvekar ibland att komma in i målrutan. Alternativt kan du lägga till en liten bur i målrutan, men hemmaburen från råttor passar inte in i målrutan. Låt råttan vana i buren i några minuter före förvärvet. Dessutom kan en annan råtta från samma hemmabur placeras i målrutan eller in i buren inne i målboxen. Se till att den andra råttan förblir i lådan och inte blockerar ingången till mållådan. Dessutom är det också möjligt att ta bort målrutan från CatWalk-systemet och placera råttan hemburen i slutet av gångvägen, vilket gör att råttan kan komma in i sitt “hemterritorium” efter varje körning. För installationen av balkens gånguppgift och stegen rung walking uppgift rekommenderar vi att du lägger till en mållåda eller hemmaburen i slutet av installationen. För att säkerställa konsekvens bör CatWalk, strålgångsuppgiften och stege rung gånguppgiften utföras minst en gång i veckan med sex till tio körningar.
Även om inte varje analys gav betydande skillnader i denna studie, bör man överväga att en inkludering av genetiskt modifierade djur eller behandlingsgrupper kan producera värdefulla data som kan skilja mellan grupper från samma beteendetester.
Nervkrossskadan hade ingen effekt på råttans lokomotoriska aktivitet, som mättes på fem minuter OFT. Catwalk XT gånganalys är ett mer objektivt och känsligt verktyg för att analysera gång-, tass- och tåplacering. Efter en intensiv träning lär sig råttorna att korsa gångvägen på CatWalk XT-apparaten till standardinställningarna. Nervskadan minskar inte råttornas förmåga att korsa gångvägen. Den automatiska beräkningen av olika parametrar presenterar uppgifterna objektivt. Ytterligare information kan vinnas genom att använda modulen “Interactive Footprint Measurements” och dessa analyser gav betydande skillnader i olika parametrar för tåspridning, utskriftslängd och tassvinkel med kroppsaxel som jämförde råttor med och utan nervskada.
Råttor kan enkelt tränas för strålvandringsuppgiften. Skillnader i latens tiden att korsa strålen och i antalet fot glider per steg av nerv-skadade hindlimb upptäcktes genom att jämföra naiva med crush-skadade råttor. En nackdel med att analysera nervskadade råttor med strålgångsuppgiften är strålens storlek. Inom de första två veckorna efter ischiasnervens krossskada behöver råttorna hjälp att korsa strålen eftersom deras balans försämras. Även om vissa råttor kan korsa strålen är risken för skador orsakade av ett fall hög. Nervkrossade djur bör därför hjälpas att korsa strålen under de första två veckorna efter ischiasnervens krossskada eller längre, om det behövs. Det är dock svårt att jämföra körningar med och utan hjälp. Dessutom är motorbalansen en viktig parameter som bedöms av strålgångsuppgiften. Vi ansåg att denna parameter inte var relevant för vår nervkross råtta modell. Därför kunde poäng som beskrevs av Ohwatashi m.fl. och Johansson & Ohlsson inte användas och körningar med ofullständig stråle travers uteslöts för dataanalys18,19.
7-kategoriskalan från Metz et al. kan analysera både fram- och bakben och skilja mellan olika allvarlighetsgrader av fel i alla lemmar under stegen rung gånguppgift16,17. Genom att analysera de mest framträdande felen, som inkluderar kategorierna från 0 till 2, kunde inga skillnader av fel per steg upptäckas i bakbenet när man jämför nervskadade wt råttor med naiva wt råttor. Dessutom skilde sig latenstiden för att korsa stege rung apparaten inte mellan nervskadade wt råttor och wt naiva råttor. Djupinlärningsmodeller kan förbättra och påskynda dataanalysen av stegen som går genom ett automatiserat tillvägagångssätt.
Det är viktigt att nämna att nervkrossskadan samt alla beskrivna beteendetester lätt kan översättas till möss, genom att anpassa inställningarna och storlekarna på installationerna. Användningen av möss som modellorganism har den fördelaktiga effekten att transgena modeller för många mänskliga sjukdomar finns.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF DysTract till C.W.I.) och av tvärvetenskapligt centrum för klinisk forskning (IZKF) vid universitetet i Würzburg (N-362 till C.W.I.; Z2-CSP3 till L.R.). Dessutom har detta projekt fått finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för det europeiska programmet för landsbygdsutveckling för landsbygdsutveckling, COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover till J.V.), och från VERUM-stiftelsen. Dessutom finansieras C.W.I. av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Reseach Foundation) Project-ID 424778381-TRR 295, av Deutsche Stiftung Neurologie och ParkinsonFonds. L.R. stöds dessutom av Dystonia Medical Reseach Foundation.
Författarna tackar Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel och Louisa Frieß för deras tekniska hjälp samt Helga Brünner för djuromsorg.
Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
Beam | self made | ||
Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
Box for OFT | self made | ||
Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Dumont #2 – laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
Heating table | MEDAX | 13801 | |
Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
Kinovea | www.kinovea.org | ||
Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
Octeniderm | Schülke | 118211 | |
Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
Rubber band retractors | self made | ||
Spacer for beam | self made | ||
Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |