विज़ुअलाइज़ेशन और TGF के परिमाणीकरण π / BMP / SMAD विभिन्न द्रव कतरनी तनाव शर्तों के तहत निकटता-बंधन-परख का उपयोग कर सिग्नलिंग
Summary
यहां, हम एक साथ कल्पना करने और कई एसएमएडी परिसरों का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करते हैं जो एंडोथेलियल कोशिकाओं में निकटता बंधाव परख (पीएलए) का उपयोग करके पैथोलॉजिकल और शारीरिक द्रव कतरनी तनाव की स्थिति के संपर्क में हैं।
Abstract
ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर β (TGFπ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) सिग्नलिंग को वास्कुलचर सिस्टम के विकास और होमियोस्टैसिस के दौरान कसकर विनियमित और संतुलित किया जाता है इसलिए, इस सिग्नलिंग मार्ग में विनियमन के परिणामस्वरूप गंभीर संवहनी विकृति होती है, जैसे फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप, वंशानुगत रक्तस्रावी टेलेंजिक्टेसिया, और एथेरोस्क्लेरोसिस। एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी), रक्त वाहिकाओं की सबसे भीतरी परत के रूप में, लगातार द्रव कतरनी तनाव (एसएस) के संपर्क में आती हैं। द्रव एसएस के असामान्य पैटर्न को टीजीएफ / बीएमपी सिग्नलिंग को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, जो अन्य उत्तेजनाओं के साथ मिलकर, एथेरोजेनेसिस को प्रेरित करता है। इसके संबंध में, एथेरोप्रोन, कम लैमिनर एसएस को टीजीएफ π / बीएमपी सिग्नलिंग को बढ़ाने के लिए पाया गया था, जबकि एथेरोप्रोटेक्टिव, उच्च लैमिनर एसएस, इस सिग्नलिंग को कम करता है। कुशलतापूर्वक इन मार्गों के सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए, हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वायवीय पंप प्रणाली और निकटता बंधाव परख (पीएलए) का उपयोग करके कम लैमिनर एसएस और उच्च लैमिनर एसएस स्थितियों के तहत प्रतिलेखन कारक परिसरों के गठन की जांच करने के लिए एक वर्कफ़्लो डिज़ाइन किया है।
सक्रिय TGF π / BMP-सिग्नलिंग के लिए दो नियामक SMADs (R-SMAD) से मिलकर trimeric SMAD परिसरों के गठन की आवश्यकता होती है; SMAD2/3 और SMAD1/5/8 TGF और BMP सिग्नलिंग के लिए क्रमशः) एक सामान्य मध्यस्थ SMAD (सह-SMAD) के साथ; SMAD4)। पीएलए का उपयोग करके ट्राइमेरिक एसएमएडी-कॉम्प्लेक्स के विभिन्न सबयूनिट्स को लक्षित करना, यानी, या तो आर-एसएमएडी / को-एसएमएडी या आर-एसएमएडी / आर-एसएमएडी, सक्रिय एसएमएडी ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर कॉम्प्लेक्स के गठन को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मात्रात्मक रूप से और स्थानिक रूप से मापा जा सकता है।
6 छोटे समानांतर चैनलों के साथ प्रवाह स्लाइड का उपयोग, जिसे श्रृंखला में जोड़ा जा सकता है, प्रतिलेखन कारक जटिल गठन की जांच और आवश्यक नियंत्रणों को शामिल करने की अनुमति देता है।
यहां बताए गए वर्कफ़्लो को अन्य प्रतिलेखन कारकों के लिए एसएमएडी की निकटता को लक्षित करने वाले अध्ययनों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है या विभिन्न द्रव एसएस स्थितियों में एसएमएडी के अलावा अन्य प्रतिलेखन कारक परिसरों के लिए। यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो ईसी में तरल पदार्थ एसएस प्रेरित टीजीएफ / बीएमपी सिग्नलिंग का अध्ययन करने का एक त्वरित और प्रभावी तरीका दिखाता है, दोनों मात्रात्मक और स्थानिक रूप से।
Introduction
ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर्स बीटा (TGFπ) superfamily के प्रोटीन विभिन्न प्रकार के सदस्यों के साथ pleiotropic साइटोकिन्स हैं, जिनमें TGFπs, अस्थि morphogenetic proteins (BMPs), और Activins1,2 शामिल हैं। लिगैंड बाइंडिंग रिसेप्टर ओलिगोमर्स के गठन को प्रेरित करता है जो फॉस्फोराइलेशन के लिए अग्रणी होता है और इस प्रकार, साइटोसोलिक नियामक एसएमएडी (आर-एसएमएडी) की सक्रियता। लिगेंड के उप-परिवार के आधार पर, विभिन्न आर-एसएमएडी सक्रिय होते हैं1,2। जबकि TGF और Activins मुख्य रूप से SMAD2/3 के फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करते हैं, BMPs SMAD1/5/8 फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करते हैं। हालांकि, इस बात के सबूत जमा हो रहे हैं कि बीएमपी और टीजीएफ / एक्टिविन भी संबंधित अन्य उप-परिवार के आर-एसएमएडी को सक्रिय करते हैं, एक प्रक्रिया में जिसे ‘पार्श्व सिग्नलिंग’ 3,4,5,6,7,8 कहा जाता है और यह कि मिश्रित एसएमएडी कॉम्प्लेक्स हैं, जिनमें दोनों शामिल हैं, SMAD1/5 और SMAD2/3, सदस्य 3,9 . दो सक्रिय आर-एसएमएडी बाद में सामान्य मध्यस्थ SMAD4 के साथ ट्रिमेरिक कॉम्प्लेक्स बनाते हैं। ये प्रतिलेखन कारक परिसर तब नाभिक में स्थानांतरित करने और लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को विनियमित करने में सक्षम होते हैं। SMADs विभिन्न ट्रांसक्रिप्शनल सह-उत्प्रेरकों और सह-दमनकर्ताओं की एक किस्म के साथ बातचीत कर सकते हैं, जिससे लक्ष्य जीन 10 को विनियमित करने की संभावनाओं का विविधीकरण होता है। SMAD सिग्नलिंग के विनियमन के विभिन्न प्रकार के रोगों में गंभीर निहितार्थ हैं। इसके अनुरूप, असंतुलित TGFπ/ BMP सिग्नलिंग गंभीर संवहनी विकृति का कारण बन सकती है, जैसे कि फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप, वंशानुगत रक्तस्रावी telangiectasia, या atherosclerosis3,11,12,13,14।
एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) रक्त वाहिकाओं की सबसे भीतरी परत बनाती हैं और इसलिए, कतरनी तनाव (एसएस) के संपर्क में आती हैं, जो रक्त के चिपचिपा प्रवाह द्वारा लागू एक घर्षण बल है। दिलचस्प बात यह है कि वास्कुलचर के कुछ हिस्सों में रहने वाले ईसी, जो वर्दी के उच्च स्तर के संपर्क में आते हैं, लैमिनर एसएस, को होमोस्टैटिक और क्विसेंट अवस्था में रखा जाता है। इसके विपरीत, ईसी जो कम, गैर-समान एसएस का अनुभव करते हैं, उदाहरण के लिए, विभाजन या महाधमनी आर्क की कम वक्रता पर, प्रोलिफेरेटिव होते हैं और भड़काऊ मार्गों को सक्रिय करते हैं। बदले में, बेकार ईसी की साइटें एथेरोस्क्लेरोसिस विकसित करने के लिए प्रवण हैं। दिलचस्प बात यह है कि इन एथेरोप्रोन क्षेत्रों में ईसी सक्रिय SMAD2/3 और SMAD1/516,17,18 के उच्च स्तर को प्रदर्शित करते हैं। इस संदर्भ में, बढ़ाया TGF π / BMP सिग्नलिंग atherosclerotic घावों के विकास में एक प्रारंभिक घटना के रूप में पाया गया था19 और बीएमपी सिग्नलिंग के साथ हस्तक्षेप स्पष्ट रूप से संवहनी सूजन, एथेरोमा गठन, और संबंधित कैल्सीफिकेशन 20 को कम करने के लिए पाया गया था।
निकटता बंधाव परख (पीएलए) एक जैव रासायनिक तकनीक के लिए situ21,22 में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए है. यह विभिन्न प्रजातियों के एंटीबॉडी की विशिष्टता पर निर्भर करता है जो ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन को बांध सकते हैं, जिससे एकल-कोशिका स्तर पर अंतर्जात प्रोटीन इंटरैक्शन का अत्यधिक विशिष्ट पता लगाया जा सकता है। यहां, प्राथमिक एंटीबॉडी को पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए 40 एनएम से कम की दूरी पर अपने लक्ष्य एपिटोप से बांधना पड़ता है23। इसलिए, पीएलए पारंपरिक सह-immunoprecipitation दृष्टिकोण पर बहुत फायदेमंद है, जहां अंतर्जात प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए कई मिलियन कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। पीएलए में, प्रजाति-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी, सहसंयोजक रूप से डीएनए टुकड़ों (जिसे प्लस और माइनस प्रोब कहा जाता है) से जुड़ा हुआ है, प्राथमिक एंटीबॉडी को बांधता है और यदि ब्याज के प्रोटीन बातचीत करते हैं, तो प्लस और माइनस जांच निकटता में आते हैं। डीएनए निम्नलिखित चरण में ligated हो जाता है और परिपत्र डीएनए के रोलिंग सर्कल प्रवर्धन संभव बना दिया जाता है। प्रवर्धन के दौरान, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले पूरक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स संश्लेषित डीएनए से जुड़ते हैं, जिससे इन प्रोटीन इंटरैक्शन को पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल वैज्ञानिकों को पीएलए का उपयोग करके विट्रो में एथेरोप्रोटेक्टिव और एथेरोप्रोन एसएस स्थितियों में सक्रिय एसएमएडी प्रतिलेखन परिसरों की संख्या की मात्रात्मक रूप से तुलना करने में सक्षम बनाता है। एसएस एक प्रोग्राम योग्य वायवीय पंप सिस्टम के माध्यम से उत्पन्न होता है जो परिभाषित स्तरों के लैमिनर यूनिडायरेक्शनल प्रवाह उत्पन्न करने में सक्षम है और प्रवाह दरों की चरणबद्ध वृद्धि की अनुमति देता है। यह विधि SMAD4 के साथ SMAD1/5 या SMAD2/3 के बीच इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए अनुमति देती है, साथ ही साथ मिश्रित-R-SMAD कॉम्प्लेक्स भी। इसे ट्रांसक्रिप्शनल सह-नियामकों के साथ एसएमएडी की बातचीत का विश्लेषण करने या एसएमएडी के अलावा अन्य प्रतिलेखन कारक परिसरों के लिए आसानी से विस्तारित किया जा सकता है। चित्र 1 नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों को दर्शाता है।
चित्रा 1: वर्णित प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) 6-चैनल स्लाइड में सीड कोशिकाओं को वायवीय पंप प्रणाली के साथ कतरनी तनाव के संपर्क में लाया जाता है। (बी) निश्चित कोशिकाओं का उपयोग पीएलए प्रयोग के लिए या नियंत्रण स्थितियों के लिए किया जाता है। (सी) पीएलए प्रयोगों की छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया जाता है और इमेजजे विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित पीएलए आधारित प्रोटोकॉल मात्रात्मक और स्थानिक संकल्प के साथ कतरनी तनाव के संपर्क में आने वाले ईसी में दो प्रोटीन (जैसे, उनकी सीधी बातचीत) की निकटता निर्धारित करने का एक कुशल तरीका प्रदान कर?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ मारिया Reichenbach और डॉ क्रिश्चियन Hiepen प्रवाह पर उनके समर्थन के लिए धन्यवाद स्थापित प्रणाली और एलेनोर फॉक्स और Yunyun Xiao गंभीर रूप से पांडुलिपि पढ़ने के लिए. पी-एल.M को अंतर्राष्ट्रीय मैक्स प्लैंक रिसर्च स्कूल आईएमपीआरएस-बायोलॉजी एंड कंप्यूटेशन (आईएमपीआरएस-बीएसी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। पीके को DFG-SFB1444 द्वारा धन प्राप्त हुआ। चित्रा 1 BioRender का उपयोग कर बनाया गया था।
Materials
| µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
| Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
| Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
| DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
| DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
| Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
| Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
| FIJI | Image Analysis software | ||
| Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
| Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
| Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
| GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
| HUVECs | |||
| ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
| ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
| Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
| L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
| mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
| mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
| mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
| Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
| Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
| Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
| rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
| Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
| Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |
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