Brug af baseplating og et miniskop, der er præforankret med en objektiv linse til calciumtransient forskning i mus
Summary
Krympningen af tandcement under hærdning fortrænger bundpladen. Denne protokol minimerer problemet ved at skabe et indledende fundament for tandcementen, der efterlader plads til at cementere bundpladen. Uger senere kan bundpladen cementeres på plads på dette stillads ved hjælp af lidt ny cement og derved reducere krympning.
Abstract
Neuroscientists bruger miniature mikroskoper (miniscopes) til at observere neuronal aktivitet i frit opfører dyr. University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet giver åbne ressourcer til forskere til selv at bygge miniscopes. V3 UCLA Miniscope er et af de mest populære open source-miniskoper, der i øjeblikket er i brug. Det tillader billeddannelse af fluorescenstransienter, der udsendes fra genetisk modificerede neuroner gennem en objektiv linse implanteret på den overfladiske cortex (et system med en linse) eller i dybe hjerneområder gennem en kombination af en relælinse implanteret i den dybe hjerne og en objektiv linse, der er præforankret i miniskopet for at observere det videresendte billede (et to-linsesystem). Selv under optimale forhold (når neuroner udtrykker fluorescensindikatorer, og relælinsen er korrekt implanteret), kan en volumenændring af tandcementen mellem bundpladen og dens fastgørelse til kraniet ved cementhærdning forårsage forskydning med en ændret afstand mellem objektiv- og relælinserne, hvilket resulterer i den dårlige billedkvalitet. En bundplade er en plade, der hjælper med at montere miniskopet på kraniet og fastgør arbejdsafstanden mellem objektiv- og relælinserne. Således ændrer ændringer i volumenet af tandcement omkring bundpladen afstanden mellem linserne. Denne protokol har til formål at minimere forskydningsproblemet forårsaget af volumenændringer i tandcementen. Protokollen reducerer forskydningen ved at opbygge et indledende fundament af tandcement under relælinseimplantation. Rekonvalescenstiden efter implantation er tilstrækkelig til, at fundamentet af tandcement hærder bundpladen fuldstændigt, så bundpladen kan cementeres på dette stillads ved hjælp af så lidt ny cement som muligt. I denne artikel beskriver vi strategier til baseplating i mus for at muliggøre billeddannelse af neuronal aktivitet med en objektiv linse forankret i miniskopet.
Introduction
Fluorescerende aktivitetsreportere er ideelle til billeddannelse af neuronal aktivitet, fordi de er følsomme og har store dynamiske områder 1,2,3. Derfor bruger et stigende antal eksperimenter fluorescensmikroskopi til direkte at observere neuronal aktivitet 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Det første miniaturiserede en-foton fluorescensmikroskop (miniscope) blev designet i 2011 af Mark Schnitzer et al.5. Dette miniskop gør det muligt for forskere at overvåge cerebellære cellers fluorescensdynamik i dyr, der opfører sig frit5 (dvs. uden fysisk fastholdelse, nakkestøtte, sedation eller bedøvelse til dyrene). I øjeblikket kan teknikken anvendes til at overvåge overfladiske hjerneområder såsom cortex 6,8,15,16; subkortikale områder såsom dorsal hippocampus 8,11,13,14 og striatum 6,17; og dybe hjerneområder såsom ventral hippocampus 14, amygdala 10,18 og hypothalamus 8,12.
I de senere år er der udviklet flere open source-miniskoper4,5,6,7,11,13,17,19. Miniskopet kan samles økonomisk af forskere, hvis de følger de trinvise retningslinjer fra University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet4,7,11,13. Fordi optisk overvågning af neural aktivitet er begrænset af begrænsningerne i lystransmission7 til og fra neuronpopulationen af interesse blev der designet et miniskop, der kræver, at en objektiv gradientbrydningsindeks (GRIN) linse (eller objektiv linse) skal forankres i bunden af miniskopet for at forstørre synsfeltet, der videresendes fra en relæ GRIN-linse (eller relælinse)6,7,8,10,16,17. Denne relælinse implanteres i målhjerneområdet, således at fluorescensaktiviteten i målhjerneområdet videresendes til overfladen af relælinsen6,7,8,10,16,17. Ca. 1/4 af en fuld sinusformet periode med lys bevæger sig gennem objektiv GRIN-linsen (~ 0,25 tonehøjde) (Figur 1A1), hvilket resulterer i et forstørret fluorescensbillede6,7. Objektivlinsen er ikke altid fastgjort i bunden af miniskopet, og implantation af relælinsen er heller ikke nødvendig6,7,11,13,15. Specifikt er der to konfigurationer: en med en fast objektiv linse i miniskopet og en relælinse implanteret i hjernen8,10,12,14,16 (Figur 1B1) og en anden med kun et aftageligt objektivobjektiv6,7,11,13,15 (Figur 1B2). I designet baseret på kombinationen af det faste objektiv og implanterede relælinse bringes fluorescenssignalerne fra hjernen til relælinsens øverste overflade (Figur 1A1)7,8,10,12,14,16. Derefter kan objektivlinsen forstørre og transmittere synsfeltet fra relælinsens øverste overflade (Figur 1A2). På den anden side er det aftagelige objektive GRIN-linsedesign mere fleksibelt, hvilket betyder, at præimplantation af en relælinse i hjernen ikke er obligatorisk (Figur 1B2)6,7,11,13,15. Når du bruger et miniskop baseret på et aftageligt objektivlinsedesign, skal forskere stadig implantere en linse i målhjerneområdet, men de kan enten implantere en objektiv linse6,7,11,13,15 eller en relælinse i hjernen6,7. Valget af et mål eller en relælinse til implantation bestemmer den miniskopkonfiguration, som forskeren skal bruge. For eksempel er V3 UCLA Miniscope baseret på et aftageligt objektiv GRIN-objektivdesign. Forskere kan vælge enten direkte at implantere en objektiv linse i hjerneområdet af interesse og montere det “tomme” miniskop på objektivlinsen6,7,11,13,15 (et system med én linse; Figur 1B2) eller til at implantere en relælinse i hjernen og montere et miniskop, der er præforankret med en objektiv linse6,7 (et system med to linser; Figur 1B1). Miniskopet fungerer derefter som et fluorescenskamera til at fange livestream-billeder af neuronal fluorescens produceret af en genetisk kodet calciumindikator1,2,3. Når miniskopet er tilsluttet en computer, kan disse fluorescensbilleder overføres til computeren og gemmes som videoklip. Forskere kan studere neuronal aktivitet ved at analysere de relative ændringer i fluorescens med nogle analysepakker20,21 eller skriv deres koder til fremtidig analyse.
V3 UCLA Miniscope giver brugerne fleksibilitet til at bestemme, om neuronal aktivitet skal afbildes med et system med et eller to linser7. Valget af registreringssystem er baseret på dybden og størrelsen af målhjerneområdet. Kort sagt kan et system med ét objektiv kun afbilde et område, der er overfladisk (mindre end ca. 2,5 mm dybt) og relativt stort (større end ca. 1,8 x 1,8 mm2), fordi producenterne kun producerer en vis størrelse objektivobjektiv. I modsætning hertil kan et to-linse system anvendes på ethvert mål hjerneområde. Imidlertid har tandcementen til limning af bundpladen tendens til at forårsage forkert justering med en ændret afstand mellem objektiv- og relælinserne, hvilket resulterer i en dårlig billedkvalitet. Hvis systemet med to objektiver anvendes, skal to arbejdsafstande målrettes præcist for at opnå den optimale billedkvalitet (figur 1A). Disse to kritiske arbejdsafstande er mellem neuronerne og den nederste overflade af relælinsen og mellem relælinsens øverste overflade og objektivlinsens nederste overflade (figur 1A1). Enhver forkert justering eller forkert placering af objektivet uden for arbejdsafstanden resulterer i billedfejl (figur 1C2). I modsætning hertil kræver systemet med ét objektiv kun én præcis arbejdsafstand. Imidlertid begrænser objektivlinsestørrelsen dens anvendelse til overvågning af dybe hjerneområder (objektivlinsen, der passer til miniskopet, er ca. 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Derfor er implantation af en objektiv linse begrænset til observation af overfladen og relativt store hjerneområder, såsom cortex6,15 og dorsal cornu ammonis 1 (CA1) hos mus11,13 . Derudover skal et stort område af cortex aspireres for at målrette dorsal CA111,13. På grund af begrænsningen af konfigurationen med én linse, der forhindrer billeddannelse af dybe hjerneområder, tilbyder kommercielle miniskopsystemer kun et kombineret objektivobjektiv/relæobjektiv (to-linse) design. På den anden side kan V3 UCLA miniscope ændres til enten et et-linse eller to-linse system, fordi dets objektiv linse er aftagelig 6,11,13,15. Med andre ord kan V3 UCLA miniscope-brugere drage fordel af den aftagelige linse ved at implantere den i hjernen (skabe et system med en linse), når de udfører eksperimenter, der involverer overfladiske hjerneobservationer (mindre end 2,5 mm i dybden) eller ved at forankre det i miniskopet og implantere en relælinse i hjernen (skabe et to-linsesystem), når du udfører eksperimenter, der involverer dybe hjerneobservationer. To-linsesystemet kan også anvendes til overfladisk observation af hjernen, men forskeren skal kende de nøjagtige arbejdsafstande mellem objektivlinsen og relælinsen. Den største fordel ved systemet med ét objektiv er, at der er en mindre risiko for at overskride arbejdsafstandene end med et system med to objektiver, da der er to arbejdsafstande, der skal målrettes præcist for at opnå optimal billedkvalitet i systemet med to objektiver (figur 1A). Derfor anbefaler vi at bruge et system med én linse til overfladiske hjerneobservationer. Men hvis eksperimentet kræver billeddannelse i det dybe hjerneområde, skal forskeren lære at undgå forkert justering af de to linser.
Den grundlæggende protokol for to-linse konfiguration af miniskoper til eksperimenter omfatter linseimplantation og baseplating 8,10,16,17. Baseplating er limning af en bundplade på et dyrs hoved, så miniskopet til sidst kan monteres oven på dyret og videobånd fluorescenssignalerne fra neuroner (figur 1B). Denne procedure involverer brug af tandcement til at lime bundpladen på kraniet (figur 1C), men krympning af tandcement kan forårsage uacceptable ændringer i afstanden mellem den implanterede relælinse og objektivlinsen 8,17. Hvis den forskudte afstand mellem de to linser er for stor, kan cellerne ikke bringes i fokus.
Detaljerede protokoller for dybe hjernekalciumbilleddannelseseksperimenter ved hjælp af miniskoper er allerede blevet offentliggjort8,10,16,17. Forfatterne af disse protokoller har brugt Inscopix-systemet8,10,16 eller andre tilpassede designs17 og har beskrevet de eksperimentelle procedurer for viral udvælgelse, kirurgi og baseplate fastgørelse. Imidlertid kan deres protokoller ikke anvendes præcist på andre open source-systemer, såsom V3 UCLA Miniscope-systemet, NINscope6og Finchscope19. Forkert justering af de to linser kan forekomme under optagelsen i en to-linsekonfiguration med et UCLA Miniscope på grund af den type tandcement, der bruges til at cementere bundpladen til kraniet8,17 (Figur 1C). Den nuværende protokol er nødvendig, fordi afstanden mellem den implanterede relælinse og objektivlinsen er tilbøjelig til at skifte på grund af uønsket krympning af tandcement under baseplatingproceduren. Under bundplettering skal den optimale arbejdsafstand mellem det implanterede relæobjektiv og objektivlinsen findes ved at justere afstanden mellem miniskopet og toppen af relælinsen, og bundpladen skal derefter limes på dette ideelle sted. Når den korrekte afstand mellem objektivlinsen og den implanterede relælinse er indstillet, kan der opnås længdemålinger ved cellulær opløsning (Figur 1B; in vivo optagelse). Da det optimale arbejdsområde for en relælinse er lille (50 – 350 μm)4,8, kan overdreven cementkrympning under hærdning gøre det vanskeligt at holde objektivlinsen og den implanterede relælinse inden for det passende område. Det overordnede mål med denne rapport er at tilvejebringe en protokol til reduktion af krympeproblemerne8,17 , der forekommer under baseplating-proceduren og for at øge succesraten for miniskopoptagelser af fluorescenssignaler i en to-linsekonfiguration. Vellykket miniskopoptagelse defineres som optagelse af en livestream af mærkbare relative ændringer i fluorescensen af individuelle neuroner i et dyr, der opfører sig frit. Selvom forskellige mærker af tandcement har forskellige krympningshastigheder, kan forskere vælge et mærke, der tidligere er testet6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Imidlertid er ikke alle mærker lette at få i nogle lande / regioner på grund af importreglerne for medicinske materialer. Derfor har vi udviklet metoder til at teste krympningshastighederne for tilgængelige tandcementer og, vigtigst af alt, give en alternativ protokol, der minimerer krympningsproblemet. Fordelen i forhold til den nuværende baseplating-protokol er en stigning i succesraten for calciumbilleddannelse med værktøjer og cement, der let kan opnås i laboratorier. UCLA-miniskopet bruges som eksempel, men protokollen gælder også for andre miniskoper. I denne rapport beskriver vi en optimeret baseplating-procedure og anbefaler også nogle strategier til montering af UCLA-miniscope-to-linsesystemet (Figur 2A). Både eksempler på vellykket implantation (n = 3 mus) og eksempler på mislykket implantation (n = 2 mus) til to-linsekonfigurationen med UCLA-miniskopet præsenteres sammen med diskussionerne om årsagerne til succeser og fiaskoer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne rapport beskriver en detaljeret eksperimentel protokol for forskere, der bruger UCLA Miniscope-systemet med to linser. Værktøjerne designet i vores protokol er relativt overkommelige for ethvert laboratorium, der ønsker at prøve in vivo calciumbilleddannelse. Nogle protokoller, såsom viral injektion, linseimplantation, dummy baseplating og baseplating, kan også bruges til andre versioner af miniscope-systemet for at forbedre succesraten for calciumbilleddannelse. Bortset fra generelle problemer med v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (108-2320-B-002-074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O’Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
