Langsgående oppfølging av urinveisinfeksjoner og deres behandling hos mus ved bruk av bioluminescensavbildning
Summary
Dette manuskriptet beskriver den intravesiske administrasjonen av uropatogene bakterier med lux operon for å indusere en urinveisinfeksjon hos mus og påfølgende langsgående in vivoanalyse av bakteriebelastningen ved hjelp av bioluminescensavbildning.
Abstract
Urinveisinfeksjoner (UVI) rangerer blant de vanligste bakterielle infeksjonene hos mennesker og behandles rutinemessig med empiriske antibiotika. På grunn av økende mikrobiell resistens har effekten av de mest brukte antibiotika imidlertid gått ned. For å finne alternative behandlingsalternativer er det et stort behov for en bedre forståelse av UVI-patogenesen og mekanismene som bestemmer UVI-følsomhet. For å undersøke dette i en dyremodell er en reproduserbar, ikke-invasiv analyse for å studere UTI-kurset uunnværlig.
I årevis har gullstandarden for opplisting av bakteriebelastning vært bestemmelse av Kolonidannende enheter (CFU) for et bestemt prøvevolum. Denne teknikken krever organhomogenater og serielle fortynninger etter mortem, noe som begrenser datautgang og reproduserbarhet. Som et alternativ blir bioluminescensavbildning (BLI) stadig mer populært for å bestemme bakteriebelastningen. Merking av patogener med lux operon tillater sensitiv deteksjon og kvantifisering på en ikke-invasiv måte, og muliggjør dermed langsgående oppfølging. Så langt er adopsjonen av BLI i UVI-forskning fortsatt begrenset.
Dette manuskriptet beskriver den praktiske implementeringen av BLI i en muse urinveisinfeksjonsmodell. Her gis en trinnvis guide for dyrking av bakterier, intravesisk instillasjon og avbildning. In vivo-korrelasjonen med CFU undersøkes og et konseptbevis er gitt ved å sammenligne bakteriebelastningen til ubehandlede infiserte dyr med antibiotikabehandlede dyr. Videre diskuteres fordelene, begrensningene og hensynene som er spesifikke for implementeringen av BLI i en in vivo UTI-modell. Implementeringen av BLI på UTI-forskningsfeltet vil i stor grad legge til rette for forskning på patogenesen av UVI og oppdagelsen av nye måter å forebygge og behandle UVI på.
Introduction
Urinveisinfeksjoner (UVI) er blant de vanligste bakterielle infeksjonene hos mennesker. Nesten halvparten av alle kvinner vil oppleve en symptomatisk UVI i løpet av livet1. Infeksjoner begrenset til blæren kan gi opphav til urinsymptomer som økning i urinfrekvens, haster, hematuri, inkontinens og smerte. Når infeksjonen stiger opp til øvre urinveier, utvikler pasienter pyelonefritt, med ubehag, feber, frysninger og ryggsmerter. Videre lider opptil 20% av pasientene med UVI av tilbakevendende infeksjoner, noe som resulterer i en dramatisk reduksjon i antibiotikafølsomhet2,3,4. De siste årene har det vært en økende interesse for nye terapier for behandling og forebygging av tilbakevendende UVI. Til tross for en bedre forståelse av den medfødte og adaptive immuniteten i nedre urinveier og av bakterielle virulensfaktorer som er nødvendige for invasjon og kolonisering, har ingen radikale endringer i behandlingsregimet blitt oversatt til den daglige urologiske praksisen2. For å studere UVI patogenese og følsomhet i vivo, er en reproduserbar og ikke-invasiv analyse uunnværlig.
Flere dyr UTI-modeller har blitt beskrevet som spenner fra nematoder til primater, men murinmodellen brukes hovedsakelig5,6. Denne modellen består av transuretral kateterisering av (kvinnelige) mus og etterfølgende instillasjon av en bakteriell suspensjon, oftest uropathogenic Escherichia coli (UPEC), direkte inn i blærelummen7. Etter inokulering har bakteriebelastningen tradisjonelt blitt kvantifisert ved å bestemme kolonidannende enheter (CFU). Denne teknikken krever ofre dyr for å oppnå post-mortem organ homogenater og serielle fortynninger, begrense datautgang og reproduserbarhet. Videre er langsgående oppfølging av bakteriebelastningen hos enkelte dyr ikke mulig ved hjelp av denne teknikken.
I 1995 foreslo Contag et al. bruk av bioluminescent-taggede patogener for å overvåke sykdomsprosesser hos levende dyr8,9. Siden da har bioluminescensavbildning (BLI) blitt brukt på mange infeksjonsmodeller som meningitt, endokarditt, osteomyelitt, hud og bløtvevsinfeksjoner, etc.10,11,12. I murin UTI-modellen kan en UPEC-stamme med hele lux operon (luxCDABE) fra Photorhabdus luminescens brukes13. En enzymatisk reaksjon er katalysert av bakteriell luciferase som er avhengig av oksidasjon av langkjedede aldehyder som reagerer med redusert flavinmononukleotid i nærvær av oksygen, noe som gir den oksiderte flavin, en langkjedet fettsyre og lys12. Lux operonkoder for luciferase og andre enzymer som kreves for syntesen av substratene. Derfor vil alle metabolsk aktive bakterier kontinuerlig avgi blått grønt (490 nm) lys uten behov for injeksjon av et eksogent substrat12. Fotoner som slippes ut av lux-taggedebakterier kan fanges opp ved hjelp av svært følsomme, avkjølte ladekoblede enhetskameraer (CCD).
Bruk av bioluminescerende bakterier i en modell for UVI muliggjør langsgående, ikke-invasiv kvantifisering av bakteriebelastningen, og utelater behovet for å ofre dyr på faste tidspunkter under oppfølgingen av CFU-bestemmelse. Til tross for det brede spekteret av muligheter, akkumulere bevis for robustheten av denne BLI-teknikken på andre felt og dens fordeler i forhold til klassiske modeller av UVI, har den ikke blitt implementert i UTI-forskningen. Protokollen som presenteres her gir en detaljert trinnvis guide og fremhever fordelene med BLI for all fremtidig UVI-forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fordeler med BLI sammenlignet med CFU teller
Langsgående data
En stor ulempe ved den tradisjonelle metoden for å telle CFU for å kvantifisere mikrobiell byrde er kravet om organhomogenater etter mortem, og gir bare ett tverrsnittsdatapunkt per dyr. På den annen side muliggjør BLI ikke-invasiv langsgående oppfølging av infiserte dyr. Dyrene kan avbildes 2 til 3 ganger om dagen, og gir detaljert innsikt i infeksjonens kinetikk. I tillegg reduserer gjentatte tiltak av samme dyr drastis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Forskningsstiftelsen – Flandern (FWO Vlaanderen; G0A6113N), Forskningsrådet for KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. og W.E.) og VIB (til T.V.). W.E. er senior klinisk forsker ved Forskningsstiftelsen – Flandern (FWO Vlaanderen). Belastningen UTI89-lux var en sjenerøs gave fra Prof. Seeds laboratorium13.
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O’Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
