En Ex Vivo Brain Slice-modell for å studere og målrette brystkreft hjerne metastatisk tumorvekst
Summary
Vi introduserer en protokoll for måling av sanntids legemiddel- og strålingsrespons av brystkreft hjernemetastatiske celler i en organotypisk hjerneskivemodell. Metodene gir en kvantitativ analyse for å undersøke de terapeutiske effektene av ulike behandlinger på hjernemetastaser fra brystkreft på en ex vivo-måte i hjernemikromiljøet.
Abstract
Hjernemetastase er en alvorlig konsekvens av brystkreft for kvinner, da disse svulstene er vanskelige å behandle og er forbundet med dårlige kliniske utfall. Prekliniske musemodeller av brystkreft hjernemetastatisk (BCBM) vekst er nyttige, men er dyre, og det er vanskelig å spore levende celler og tumorcelleinvasjon i hjernen parenchyma. Presentert her er en protokoll for ex vivo hjerneskive kulturer fra xenografted mus som inneholder intracranially injisert brystkreft hjernesøkende klonale underlinjer. MDA-MB-231BR luciferase taggede celler ble injisert intracranially i hjernen til Nu / Nu kvinnelige mus, og etter tumordannelse ble hjernene isolert, skiver og dyrket ex vivo. Tumorskivene ble avbildet for å identifisere tumorceller som uttrykker luciferase og overvåke spredning og invasjon i hjernen parenchyma i opptil 10 dager. Videre beskriver protokollen bruken av tidsforløpmikroskopi for å avbilde veksten og den invasive oppførselen til tumorcellene etter behandling med ioniserende stråling eller kjemoterapi. Responsen fra tumorceller til behandlinger kan visualiseres ved levende avbildningsmikroskopi, måling av bioluminescensintensitet og utføre histologi på hjernestykket som inneholder BCBM-celler. Dermed kan denne ex vivo-skivemodellen være en nyttig plattform for rask testing av nye terapeutiske midler alene eller i kombinasjon med stråling for å identifisere legemidler som er personlig tilpasset for å målrette en individuell pasients brystkrefthjerne metastatisk vekst i hjernemikromiljøet.
Introduction
Brystkreft hjernemetastaser (BCBM) utvikler seg når celler sprer seg fra den primære brystsvulsten til hjernen. Brystkreft er den nest hyppigste årsaken til hjernemetastase etter lungekreft, med metastaser som forekommer hos 10-16% av pasientene1. Dessverre forblir hjernemetastaser uhelbredelige ettersom >80% av pasientene dør innen et år etter hjernemetastasediagnosen, og deres livskvalitet er svekket på grunn av nevrologiske dysfunksjoner2. Det er et presserende behov for å identifisere mer effektive behandlingsalternativer. Monolayer todimensjonale eller tredimensjonale kulturmodeller er de mest brukte metodene for å teste terapeutiske midler i laboratoriet. Imidlertid etterligner de ikke det komplekse BCBM mikromiljøet, en stor driver for tumorfenotype og vekst. Selv om disse modellene er nyttige, fanger de ikke de komplekse tumor-stromale interaksjonene, de unike metabolske kravene og heterogeniteten til svulstene3. For mer trofast å rekapitulere tumor-stromale interaksjoner og mikromiljø heterogenitet, har vår gruppe og andre begynt å generere organotypiske hjernemetastasekulturer med pasientavledede tumorceller (primære eller metastatiske) eller kreftcellelinjer 4,5,6. Sammenlignet med klassiske in vitro-systemer, kan denne kortsiktige ex vivo-modellen gi mer relevante forhold for screening av nye terapeutiske behandlinger før preklinisk vurdering i store dyrekohorter.
Ex vivo modeller har blitt konstruert og vellykket brukt primært for identifisering av vellykkede behandlinger av ulike kreftformer. De krever få dagers vurdering og kan i tillegg skreddersys til pasientspesifikk legemiddelscreening. For eksempel har human blære og prostatakreft ex vivo vev vist en doseavhengig anti-tumor respons av docetaksel og gemcitabine7. Lignende kolorektal karsinom ex vivo vev ble utviklet for å screene kjemoterapeutiske legemidler Oxaliplatin, Cetuximab og Pembrolizumab8. Denne applikasjonen har blitt mye brukt i bukspyttkjertelkreft, med tanke på det essensielle samspillet mellom det stromale miljøet og de genotypiske og fenotypiske egenskapene til bukspyttkjertelkanal adenokarsinom 9,10. Videre er slike organotypiske modeller utviklet for lignende screeninger i hode-, nakke-, mage- og brystsvulster 11,12.
Her genereres en ex vivo hjerneskivemodell av xenografted brystkreft hjerne metastatiske tumorceller i mikromiljøet. Mus ble intracranially injisert med brystkreft hjerne metastatisk hjerne trofisk MDA-MB-231BR celler13 i cerebral cortex parietal lobe- et vanlig sted for TNBC metastasering14,15 og fikk lov til å utvikle svulster. Hjerneskiver ble generert fra disse xenografterte dyrene og opprettholdt ex vivo som organotypiske kulturer som beskrevet16,17. Denne nye ex vivo-modellen tillater analyse av BCBM-cellens vekst i hjerneparenchyma og kan brukes til å teste terapeutiske midler og strålingseffekter på tumorceller i hjernemikromiljøet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien etablerer en ny ex vivo hjernekulturmetode for utplantede xenograft hjernesvulster. Vi viser at BCBM celler MDA-MB-231BR celler intracranially injisert i hjernen til mus kan overleve og vokse i ex vivo hjerne skiver. Studien testet også intracranially injiserte U87MG glioblastom (GBM) celler og fant også at disse kreftcellene overlever og vokser i hjerneskiver (data ikke vist). Vi tror denne modellen kan utvides utover BCBM og GBM til andre kreftformer som lett metastaser til hjernen, in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil takke Julia Farnan, Kayla Green og Tiziana DeAngelis for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble delvis støttet av Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) og W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Recherche en cancérologie. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel’s mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice–a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Recherche en cancérologie. 80 (20), 4314-4323 (2020).
