Användningen av Patch-Clamp-tekniken för att studera mitokondriernas termogena kapacitet

Summary

Denna metodartikel beskriver de viktigaste stegen för att mäta H ⁺ -läckage över det inre mitokondriella membranet med patch-clamp-tekniken, ett nytt tillvägagångssätt för att studera mitokondriernas termogena kapacitet.

Abstract

Mitokondriell termogenes (även känd som mitokondriell frikoppling) är ett av de mest lovande målen för att öka energiförbrukningen för att bekämpa metaboliskt syndrom. Termogena vävnader som bruna och beige fetter utvecklar högspecialiserade mitokondrier för värmeproduktion. Mitokondrier i andra vävnader, som främst producerar ATP, omvandlar också upp till 25% av den totala mitokondriella energiproduktionen till värme och kan därför ha en betydande inverkan på hela kroppens fysiologi. Mitokondriell termogenes är inte bara viktigt för att upprätthålla kroppstemperaturen utan förhindrar också dietinducerad fetma och minskar produktionen av reaktiva syrearter (ROS) för att skydda celler från oxidativ skada. Eftersom mitokondriell termogenes är en viktig regulator för cellulär metabolism, kommer en mekanistisk förståelse av denna grundläggande process att hjälpa till vid utvecklingen av terapeutiska strategier för att bekämpa många patologier associerade med mitokondriell dysfunktion. Viktigt är att de exakta molekylära mekanismerna som styr akut aktivering av termogenes i mitokondrier är dåligt definierade. Denna brist på information beror till stor del på brist på metoder för direkt mätning av frikopplande proteiner. Den senaste utvecklingen av patch-clamp-metodik tillämpad på mitokondrier möjliggjorde för första gången den direkta studien av fenomenet vid ursprunget till mitokondriell termogenes, H ⁺ -läckage genom IMM och den första biofysiska karakteriseringen av mitokondriella transportörer som är ansvariga för det, det frikopplande proteinet 1 (UCP1), specifikt för bruna och beige fetter, och ADP / ATP-transportören (AAC) för alla andra vävnader. Detta unika tillvägagångssätt kommer att ge nya insikter om de mekanismer som styr H ⁺ -läckage och mitokondriell termogenes och hur de kan riktas för att bekämpa metaboliskt syndrom. Detta dokument beskriver patch-clamp-metoden som tillämpas på mitokondrier för att studera deras termogena kapacitet genom att direkt mäta H ^{+ –} strömmar genom IMM.

Introduction

Mitokondrier är kända för att vara cellens kraftverk. De är faktiskt den största källan till kemisk energi, ATP. Vad som är mindre känt är att mitokondrier också genererar värme. Faktum är att varje mitokondrion ständigt genererar de två typerna av energier (ATP och värme) och en fin balans mellan de två energiformerna definierar metabolisk cellhomeostas (Figur 1). Hur mitokondrier fördelar energi mellan ATP och värme är verkligen den mest grundläggande frågan inom bioenergetik, även om det fortfarande är till stor del okänt. Vi vet att ökad mitokondriell värmeproduktion (kallad mitokondriell termogenes) och därmed minska ATP-produktionen ökar energiförbrukningen och detta är ett av de bästa sätten att bekämpa metaboliskt syndrom¹.

Mitokondriell termogenes härstammar från H ⁺ -läckage över det inre mitokondriella membranet (IMM), vilket leder till frikoppling av substratoxidation och ATP-syntes med därmed produktion av värme, därav namnet “mitokondriell frikoppling”¹ (Figur 1). Denna H ^{+ –}läcka beror på mitokondriella transportörer som kallas frikopplingsproteiner (UCP). UCP1 var det första UCP som identifierades. Det uttrycks endast i termogena vävnader, brunt fett och beige fett där mitokondrier är specialiserade för värmeproduktion ^2,3,4. Identiteten av UCP i icke-fettvävnader såsom skelettmuskulatur, hjärta och lever har förblivit kontroversiell. Mitokondrier i dessa vävnader kan ha cirka 25% av den totala mitokondriella energin omvandlad till värme, vilket kan påverka hela kroppens fysiologi avsevärt¹. Förutom att upprätthålla kärnkroppstemperaturen förhindrar mitokondriell termogenes också dietinducerad fetma genom att minska kalorierna. Dessutom minskar det produktionen av reaktiva syrearter (ROS) av mitokondrier för att skydda celler från oxidativ skada¹. Således är mitokondriell termogenes involverad i normalt åldrande, åldersrelaterade degenerativa störningar och andra tillstånd som involverar oxidativ stress, såsom ischemi-reperfusion. Därför är mitokondriell termogenes en kraftfull regulator för cellulär metabolism, och en mekanistisk förståelse av denna grundläggande process kommer att främja utvecklingen av terapeutiska strategier för att bekämpa många patologier associerade med mitokondriell dysfunktion.

Mitokondriell andning var den första tekniken som avslöjade mitokondriell termogenes avgörande roll i cellulär metabolism och är fortfarande den mest populära i samhället¹. Denna teknik är baserad på mätning av syreförbrukning av mitokondriell elektrontransportkedja (ETC) som ökar när mitokondriell H ⁺ -läcka aktiveras. Denna teknik, även om den är instrumentell, kan inte direkt studera mitokondriell H ⁺ -läcka över IMM¹, vilket gör den exakta identifieringen och karakteriseringen av proteinerna som är ansvariga för det svårt, särskilt i icke-fettvävnader där värmeproduktionen är sekundär jämfört med ATP-produktion. Nyligen gav utvecklingen av patch-clamp-tekniken som tillämpas på mitokondrier den första direkta studien av H ⁺ -läckage över hela IMM i olika vävnader ^5,6,7.

Mitokondriell patch-klämma för hela IMM etablerades först på ett reproducerbart sätt av Kirichok et ^al.8. De beskrev den första direkta mätningen av mitokondriella kalcium uniporterströmmar (MCU) 2004 med hjälp av mioplaster från COS-7 cellinjer⁸. Senare visade Kirichok-labbet kalciumströmmar från IMMs av mus⁹ och Drosophila-vävnader ⁹. Andra laboratorier använder nu rutinmässigt denna teknik för att studera de biofysiska egenskaperna hos MCU 10,11,12,13,14. Hela IMM-patch-clamp-analys av kalium- och kloridkonduktans är också möjlig och har nämnts i flera artiklar men har ännu inte varit huvudämnet för en publikation ^6,7,9. Den första mätningen av H⁺ strömmar över IMM rapporterades 2012 från musbruna fett mitokondrier⁶ och från musbeige fett mitokondrier 2017⁷. Denna ström beror på det specifika frikopplingsproteinet i termogena vävnader, UCP1 ^6,7. Nyligen publicerat arbete 2019 karakteriserade AKK som det huvudsakliga proteinet som är ansvarigt för mitokondriell H ⁺ -läcka i icke-fettvävnader som hjärtat och skelettmuskeln⁵.

Detta unika tillvägagångssätt möjliggör nu en direkt högupplöst funktionell analys av mitokondriella jonkanaler och transportörer som är ansvariga för mitokondriell termogenes. För att underlätta expansionen av metoden och för att komplettera andra studier såsom mitokondriell andning beskrivs ett detaljerat protokoll nedan för att mäta H ^{+ –} strömmarna som bärs av UCP1 och AAC. Tre viktiga steg beskrivs: 1) mitokondriell isolering från musbrunt fett för att analysera UCP1-beroende H ⁺ -ström och mitokondriell isolering från hjärtat för att analysera AAC-beroende H ⁺ -ström, 2) beredning av mioplaster med en fransk press för mekanisk bristning av det yttre mitokondriella membranet (OMM), 3) patch-clamp-inspelningar av UCP1- och AAC-beroende H ⁺ -strömmar över hela IMM.

Protocol

Alla djurförsök som utfördes överensstämmer med Riktlinjerna för National Institutes of Health och godkändes av University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). OBS: Mitokondriell isoleringsproceduren är baserad på differentiell centrifugering och varierar något från vävnad till vävnad. Till exempel, eftersom brun fettvävnad är extremt rik på lipider, kräver det ett ytterligare steg för att separera cellskräp och organeller från lipi…

Representative Results

Utvecklingen av patch-clamp-metoden som tillämpas på mitokondrier gav den första direkta studien av H + -läckage genom IMM och mitokondriella transportörer, UCP1 och AAC, som är ansvariga för det. Den elektrofysiologiska analysen av UCP1- och AAC-beroende H + -läckor kan ge en första blick på mitokondriernas termogena kapacitet. I resultatavsnittet beskrivs standardprocedurerna för att mäta H+- läckage via UCP1 och AAC. UCP1-beroende H…

Discussion

Denna metodartikel syftar till att presentera patch-clamp-tekniken som nyligen applicerats på mitokondrier, ett nytt tillvägagångssätt för att direkt studera H ⁺ -läckage genom IMM som är ansvarig för mitokondriell termogenes 5,6,7,15. Denna teknik är inte begränsad till vävnader och kan också användas för att analysera H ⁺ -läckage och andra konduktanser av…

Materials

0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253