Method Article

Criblage chromosomique d’embryons humains préimplantatoires à l’aide de milieux de culture épuisés : prélèvement d’échantillons et analyse de la ploïdie chromosomique

DOI:

10.3791/62619

September 7th, 2021

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis.
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options.
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

Summary

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La présente étude fait état d’un protocole de criblage chromosomique d’embryons humains qui utilise un milieu de culture épuisé, ce qui évite la biopsie embryonnaire et permet l’identification de la ploïdie chromosomique à l’aide du NGS. Le présent article présente la procédure détaillée, y compris la préparation du milieu de culture, l’amplification du génome entier (WGA), la préparation de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération (NGS) et l’analyse des données.

Abstract

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Dans la fécondation clinique in vitro (FIV), la méthode prédominante pour le PGT-A nécessite la biopsie de quelques cellules du trophectoderme (TE). C’est la lignée qui forme le placenta. Cette méthode, cependant, nécessite des compétences spécialisées, est invasive et souffre de faux positifs et de faux négatifs, car le nombre de chromosomes dans le TE et la masse cellulaire interne (ICM), qui se développe dans le fœtus, ne sont pas toujours les mêmes. Le NICS, une technologie nécessitant le séquençage de l’ADN libéré dans le milieu de culture à la fois par TE et par ICM, peut offrir une solution à ces problèmes, mais il a déjà été démontré qu’il avait une efficacité limitée. La présente étude rend compte du protocole complet du NICS, qui comprend les méthodes d’échantillonnage des milieux de culture, l’amplification du génome entier (WGA) et la préparation de la bibliothèque, ainsi que l’analyse des données NGS par un logiciel d’analyse. Compte tenu des différents temps de cryoconservation dans les différents laboratoires d’embryons, les embryologistes disposent de deux méthodes de collecte du milieu de culture embryonnaire qui peuvent être sélectionnées en fonction des conditions réelles du laboratoire de FIV.

Introduction

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Les techniques de procréation assistée (ART) sont de plus en plus utilisées pour le traitement de l’infertilité. Cependant, le taux de réussite des traitements antirétroviraux, tels que la FIV, a été limité et le taux de fausse couche est significativement plus élevé que celui de la population normale1. La principale cause de ces problèmes est les anomalies chromosomiques, qui existent couramment dans les embryons humains préimplantatoires2. Le PGT-A est une méthode efficace de dépistage de l’équilibre chromosomique des embryons avant l’implantation 3,4. Certaine....

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Protocol

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L’autorisation éthique a été obtenue auprès du Comité d’éthique du Troisième Hôpital de l’Université de Pékin.

1. Préparation

REMARQUE : Le matériel et l’équipement requis sont énumérés dans le tableau des matériaux.

  1. Réactifs
    1. Préchauffer et équilibrer (équilibré) 20 à 30 μL de milieu de gamètes/milieu de fertilisation et milieu de culture de clivage/blastocyste (recouvert d’huile minérale) et de hyaluronidase (dans un tube hermétiquement fermé) à 37 °C, 5 % de CO 2 et 5 % d’O2 dans un incubateur tri-gaz pendant la nuit avant utilisation.
    2. Préchauff....

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Results

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La présente étude a appliqué la méthode proposée à un patient. L’approbation de la CISR et le consentement éclairé ont été obtenus avant l’application de l’analyse NICS. La présente étude a permis d’obtenir 6 blastocystes de patients et d’effectuer un NICS sur les 6 embryons du milieu du jour 4 au jour 5. Des anomalies chromosomiques causées par la translocation équilibrée des parents ont été détectées dans cinq des chromosomes avec le test NICS ; par conséquent, ils ne pouvaient pas être utilisés pour le transfert (

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Discussion

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Modifications et dépannage

Si les résultats du NICS sont contaminés par du matériel génétique parental, assurez-vous que toutes les cellules cumulus-corona radiata sont retirées et assurez-vous que l’ICSI est effectuée pour la fécondation. Les processus inadéquats de stockage du milieu ou de préparation des modèles sont évités, ce qui peut dégrader l’ADN. L’espace de travail a été purifié en profondeur avec des réactifs de décontamination DNase et RNase. Pour éviter la contami.......

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Disclosures

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Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang et Sijia Lu sont des employés de Yikon Genomics Co., Ltd.

Acknowledgements

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Les auteurs tiennent à remercier Shiping Bo et Shujie Ma pour leur aide dans l’analyse des données NGS. Financement : ces travaux ont été financés par le Programme national de recherche et de développement clé (subvention n° 2018YFC1003100).

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Materials

Il est recommandé d’utiliser un kit de préparation de bibliothèque le de de

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
tube EP de 1,5 ml, un tube PCR de 0,2 mlAxygenMCT-150-C, un tube PCR-02-Csans DNase/RNase, un tube PCR à faible liaison et des tubes micro-centrifugeurs de 1,5 ml.
10 et micro ; L, 200 et micro ; L, 1000 et micro ; L DNase /RNase Free TipsAxygenT-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-SCela peut être remplacé par une autre marque/Pour le transfert d’échantillons
100 % éthanolSinopharm Chemical10009218Cela peut être remplacé par une autre marque/Pour la purification de la bibliothèque d’ADN
Barcode Primer1-48Yikon GenomicsRéactif dans NICSInstPour l’amplification de bibliothèque
BD Falcon Organ Culture Dish, StérileBD Bioscience363037Cela peut être remplacé par une autre marque / Pour la culture d’embryons
Boîtes de culture de tissus BD Falcon (Easy Grip) , StérileBD Bioscience353001Cela peut être remplacé par une autre marque / Pour la culture d’embryons
Boîtes de culture de tissus BD Falcon, StérileBD Bioscience353002Cela peut être remplacé par une autre marque / Pour la culture d’embryons
Tampon de lyse cellulaireYikon Réactif génomiquedans le NICSInst kit de préparation de banquePour le prétraitement du milieu de culture
Enzyme de lyse cellulaireYikon GenomicsRéactif dans le NICSIkit de préparation de la banque Pourprétraitement du milieu de culture
Logiciel ChromGoYikon Genomics Analyse desdonnées
CMPure MagbeadsYikon GenomicsRéactif dans le NICSIkit de préparation de la bibliothèque NstPour la purification de la bibliothèque
Cryotop open systerm  ; KITAZATO BioPharma81110Peut être remplacé par une autre marque/Pour la vitrification
l’embryon Distiller de l’eauYikon GenomicsRéactif dans le NICSInst kit de préparation de la banquePour dissoudre l’ADN
ES (kit de vitrification)  ; KITAZATO BioPharmaKit d’invitrification de réactifsCeci peut être remplacé par une autre marque/Pour la vitrification embryonnaire
HOLDNIGORIGIOMPH-MED-35Peut être remplacé par une autre marque
/Pour solution ICSI
Hyaluronidase, 80 U/mLSAGEART4007-APeut être remplacé par une autre marque/Digest ovocyte-corona-cumulus
complexe ICSIORIGIOMPH-35-35Celui-ci peut être remplacé par une autre marque/Pour ICSI
Illumina MiSeq® ; SystèmeIlluminaSY-410-1001Pour le séquençage de la banque
IncubateurLabotectInkubator C16Il peut être remplacé par une autre marque/Pour la culture embryonnaire
Tampon de bibliothèqueYikon GenomicsReagent dans le NICSInst Kit de préparation de la banquePour l’amplification de la bibliothèque
Mélange d’enzymes de la bibliothèqueYikon Réactif de génomiquedans le NICSIkit de préparation de la bibliothèquepour la bibliothèque amplificaton
Support magnétiqueDynaMagTM-212321DPour la purification de la bibliothèque
MicroscopeOLYMPUS1X71Celui-ci peut être remplacé par une autre marque/Pour l’observation de l’embryon
Mini-centrifugeuseESSENSCIENELF6Pour la séparation
MT Enzyme MixYikon GenomicsRéactif dans le NICSInst kit de préparation de la banquePour le prétraitement du milieu de culture
NICSInst kit de préparation de bibliothèqueYikon GenomicsKT1000800324Amplification du génome entier et construction de bibliothèque
NICSInst Sample Prep StationYikon Genomics  ; ME1001003Amplification de l’ADN
Nunc IVF Plat à 4 puitsThermo Scientific144444Peut être remplacé par une autre marque/Pour le lavage d’embryons et la culture de blastocystes
PasteurPipette Oirgio  ; MXL3-IND-135Peut être remplacé par une autre marque/Pour les
pipettes PasteurORIGIOPP-9-1000Pour un laboratoire de FIV
Tampon Pre-LibYikon GenomicsRéactif dans NICSInst Kit de préparation de banquePré-bibliothèque Réactif
génomique de l’enzyme Pre-Lib Yikondans NICSInst Kit de préparation de banquePré-bibliothèque Préparation de la banque
Fluorimètre Qubit® ; 3.0Thermo ScientificQ33216Pour la quantification de la bibliothèque
Quinn’s Advantage Blastocyste MediumSAGEART-1029Pour la culture au stade du blastocyste embryonnaire
Quinn’s Advantage MediumSAGE ART-1026Il peut être remplacé par une autre marque/Pour la culture au stade du clivage de l’embryon
Quinn’s Advantage Fertilisation MediumSAGEART-1020Peut être remplacé par une autre marque/Pour la fécondation des ovocytes et des spermatozoïdes
Quinn’s Advantage m-HTF Medium avec HEPESSAGEART-1023Il peut être remplacé par une autre marque/Pour le clutrure embryonnaire
Quinn’s Advantage SPS Kit de substitution de protéines sériquesSAGEART-3010Peut être remplacé par une autre marque/Pour dénuder l’ovocyte
Quinn’s Advantage Huile minérale de culture tissulaireSAGEART-4008PPeut être remplacée par une autre marque/Pour couvrir le milieu de culture
STRIPPER TIPSORIGIOMXL3-IND-135Peut être remplacée par une autre marque/Pour dénuder les cellules de granulosa
Vitrification Cryotop Open systermKIZTAZATO81111Peut être remplacée par une autre marque/Pour la vitrification d’embryons
Kitde vitrification  ; KITAZATO BioPharmaVT101Peut être remplacé par une autre marque/Pour la vitrification d’embryons
VortexerQilinbeierDNYS8Mélange d’échantillons
VS (kit de vitrification)  ; KITAZATO BioPharmaKit d’invitrification de réactifsCela peut être remplacé par une autre marque/Pour la vitrification d’embryons
ZILOS-tk Système laserHamilton ThorneCLASSE 1 LaserCela peut être remplacé par une autre marque/Pour l’effondrement artificiel du blastocèle

References

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationshi....

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Chromosome ScreeningPreimplantation EmbryosSpent Culture MediumChromosomal Ploidy AnalysisNon Invasive Chromosome ScreeningWhole Genome AmplificationLibrary PreparationNext Generation SequencingEmbryo Culture MediumAneuploidy Detection

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