Рассечение волокон одиночных скелетных мышц для иммунофлуоресцентного и морфометрического анализа цельномышечных соединений
Summary
Способность точно обнаруживать компоненты нервно-мышечного соединения имеет решающее значение при оценке изменений в его архитектуре из-за патологических процессов или процессов развития. Здесь мы представляем полное описание простого метода получения высококачественных изображений цельномонтных нервно-мышечных соединений, которые могут быть использованы для выполнения количественных измерений.
Abstract
Нервно-мышечное соединение (NMJ) является специализированной точкой контакта между двигательным нервом и скелетной мышцей. Этот периферический синапс проявляет высокую морфологическую и функциональную пластичность. При многочисленных расстройствах нервной системы NMJ является ранней патологической мишенью, приводящей к сбою нейротрансмиссии, слабости, атрофии и даже к гибели мышечных волокон. Благодаря своей актуальности, возможность количественно оценить определенные аспекты взаимосвязи между компонентами NMJ может помочь понять процессы, связанные с его сборкой/разборкой. Первым препятствием при работе с мышцами является получение технической экспертизы для быстрого выявления и рассечения без повреждения их волокон. Вторая проблема заключается в использовании высококачественных методов обнаружения для получения изображений NMJ, которые могут быть использованы для выполнения количественного анализа. В данной статье представлен пошаговый протокол рассечения разгибателя digitorum longus и камошистых мышц у крыс. Это также объясняет использование иммунофлуоресценции для визуализации пред- и постсинаптических элементов цельномонтных NMJ. Полученные результаты демонстрируют, что этот метод может быть использован для установления микроскопической анатомии синапса и выявления тонких изменений в состоянии некоторых его компонентов при физиологических или патологических состояниях.
Introduction
Нервно-мышечное соединение млекопитающего (NMJ) представляет собой большой холинергический трехсторонний синапс, состоящий из нервного окончания двигательного нейрона, постсинаптической мембраны на скелетно-мышечном волокне и концевые шванновские клетки1,2,3. Этот синапс проявляет высокую морфологическую и функциональную пластичность4,5,6,7,8даже во взрослом возрасте, когда NMJ могут подвергаться динамическим структурным модификациям. Например, некоторые исследователи показали, что двигательные нервные окончания постоянно меняют свою форму на микрометровом масштабе9. Также сообщалось, что морфология NMJ реагирует на функциональные требования, измененное использование, старение, физические упражнения или изменения в двигательной активности4,10,11,12,13,14,15. Таким образом, тренировка и отсутствие использования представляют собой существенный стимул для изменения некоторых характеристик NMJ, таких как его размер, длина, дисперсия синаптических везикул и рецепторов, а также ветвление нервных терминалов14,16,17,18,19,20.
Кроме того, было показано, что любое структурное изменение или дегенерация этого жизненно важного соединения может привести к гибели клеток двигательных нейронов и атрофии мышц21. Также считается, что измененная связь между нервами и мышцами может быть ответственна за физиологические возрастные изменения NMJ и, возможно, за его разрушение в патологических состояниях. Демонтаж нервно-мышечного соединения играет решающую роль в возникновении бокового амиотрофического склероза (БАС), нейродегенеративного заболевания, которое представляет собой один из лучших примеров нарушения взаимодействия мышц и нервов3. Несмотря на многочисленные исследования, проведенные по дисфункции двигательных нейронов, до сих пор обсуждается, происходит ли ухудшение, наблюдаемое при БАС, из-за прямого повреждения двигательного нейрона, а затем распространяется на кортико-спинальные проекции22; или если его следует рассматривать как дистальную аксонопатию, при которой дегенерация начинается в нервных окончаниях и прогрессирует в сторону двигательных нейронов сомы23,24. Учитывая сложность патологии БАС, логично считать, что происходит смешение самостоятельных процессов. Поскольку NMJ является центральным игроком в физиопатологическом взаимодействии между мышцами и нервами, его дестабилизация представляет собой ключевую точку в происхождении заболевания, которая имеет отношение к анализу.
Нервно-мышечная система млекопитающего функционально организована в дискретные двигательные единицы, состоящие из двигательного нейрона и мышечных волокон, которые исключительно иннервируются его нервным концом. Каждый двигательный блок имеет волокна со сходными или идентичными структурно-функциональными свойствами25. Селективный набор двигательных нейронов позволяет оптимизировать реакцию мышц на функциональные требования. Теперь ясно, что скелетные мышцы млекопитающих состоят из четырех различных типов волокон. Некоторые мышцы названы в соответствии с характеристиками их наиболее распространенного типа волокон. Например, камбала (задняя мышца задней конечности, участвующей в поддержании осанки тела) несет на себе большинство медленно дергающихся единиц (тип 1) и распознается как медленная мышца. Вместо этого экстензор digitorum longus (EDL) по существу состоит из блоков с аналогичными свойствами быстрого подергивания (волокна типа 2) и известен как быстрая мышца, специализированная для фазовых движений, необходимых для передвижения. Другими словами, хотя взрослые мышцы пластичны по своей природе из-за гормональных и нервных влияний, их состав волокон определяет способность выполнять различные виды деятельности, как видно на камбале, которая испытывает непрерывную низкоинтенсивную активность, и EDL, которая демонстрирует более быстрое одиночное подергивание. Другие признаки, которые варьируются среди различных типов мышечных волокон, связаны с их структурой (содержание митохондрий, расширение саркоплазматического стикулума, толщина линии Z), содержанием АТФазы миозина и составом тяжелой цепи миозина26,27,28,29.
Для NMJ грызунов существуют значительные различия между мышцами28,29. Морфометрический анализ, проведенный в камбуше и EDL у крыс, выявил положительную корреляцию между синаптической областью и диаметром волокна (т. Е. Синаптическая область в медленных волокнах камбуша больше, чем в быстрых волокнах EDL), но соотношение между площадью NMJ и размером волокна одинаково в обеих мышцах30,31. Кроме того, по отношению к нервным окончаниям абсолютные области концевой пластины в волокнах типа 1 были ниже, чем в волокнах типа 2, тогда как нормализация по диаметру волокна сделала области нервных окончаний в волокнах типа 1 самыми большими32.
Тем не менее, очень немногие исследования сосредоточены на морфометрическом анализе, чтобы показать доказательства изменений в некоторых компонентах NMJ33,34. Таким образом, в связи с актуальностью НМЮ в функции организма, морфология и физиология которого изменяются при различных патологиях, важно оптимизировать протоколы рассечения разных типов мышц с достаточно качественным качеством, позволяющим визуализировать всю структуру НМЮ. Также необходимо оценить возникновение пред- или постсинаптических изменений в различных экспериментальных ситуациях или состояниях, таких как старение или физические упражнения35,36,37,38. Кроме того, может быть полезно провести более тонкие изменения в компонентах NMJ, такие как измененное фосфорилирование нейрофиламента в терминальных нервных окончаниях, как сообщается в ALS39.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представляем подробный протокол рассечения двух скелетных мышц крыс (одна медленно дергается, а другая быстро дергается), выделения волоконных мышц и иммунофлуоресцентного обнаружения пред- и постсинаптических маркеров для количественной оценки изменений NMJ, а также ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Большое спасибо CSIC и PEDECIBA за финансовую поддержку, оказанную этой работе; Наталье Розано за исправление рукописи; Марсело Касакуберте, который снимает видео, и Николасу Болатто за то, что он одолжил свой голос для него.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 – AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neurosciences. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neurosciences. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -. S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
