تشريح ألياف العضلات الهيكل العظمي واحد للتحليلات Immunofluorescent ومورفومتري من تقاطعات العضلات العصبية جبل كامل
Summary
تعد القدرة على الكشف بدقة عن مكونات التقاطع العصبي العضلي أمرا حاسما في تقييم التعديلات في هندسته المعمارية بسبب العمليات المرضية أو التنموية. هنا نقدم وصفا كاملا لطريقة مباشرة للحصول على صور عالية الجودة من تقاطعات الأعصاب العضلية جبل كامل التي يمكن استخدامها لأداء القياسات الكمية.
Abstract
التقاطع العصبي العضلي (NMJ) هو نقطة اتصال متخصصة بين العصب الحركي والعضلات الهيكلية. هذا المشبك الطرفية معارض عالية اللدونة مورفولوجية ووظيفية. في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي ، NMJ هو هدف مرضي مبكر يؤدي إلى فشل التضمين العصبي والضعف والضمور وحتى في موت ألياف العضلات. ونظرا لأهميتها، فإن إمكانية تقييم جوانب معينة من العلاقة بين مكونات NMJ من الناحية الكمية يمكن أن تساعد على فهم العمليات المرتبطة بتجميعها/تفكيكها. العقبة الأولى عند العمل مع العضلات هو الحصول على الخبرة التقنية لتحديد وتشريح بسرعة دون الإضرار أليافها. ويتمثل التحدي الثاني في استخدام أساليب كشف عالية الجودة للحصول على صور NMJ التي يمكن استخدامها لإجراء تحليل كمي. تقدم هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لتشريح العضلات الرقمية الملحقة وعضلات سولوس من الفئران. كما أنه يفسر استخدام immunofluorescence لتصور العناصر قبل وبعد متشابك من NMJs جبل كامل. النتائج التي تم الحصول عليها تثبت أن هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد التشريح المجهري للتشابك وتحديد التغيرات الطفيفة في حالة بعض مكوناته في ظل ظروف فسيولوجية أو مرضية.
Introduction
تقاطع الثدييات العصبية والعضلية (NMJ) هو المشبك الثلاثي الكوليني كبيرة تتكون من نهاية العصب العصبي الحركي, غشاء postynaptic على ألياف العضلات الهيكل العظمي, ومحطة خلايا شوان1,2,3. هذا المشبك معارض عالية اللدونة المورفولوجية والوظيفية4،5،6،7،8، حتى خلال مرحلة البلوغ عندما NMJs يمكن أن تخضع لتعديلات هيكلية ديناميكية. على سبيل المثال، أظهر بعض الباحثين أن النهايات العصبية الحركية تغير شكلها باستمرار على مقياس ميكرومتر9. كما أفيد أن مورفولوجيا NMJ يستجيب لمتطلبات وظيفية، تغيير الاستخدام، والشيخوخة، وممارسة، أو الاختلافات في النشاط الحركي4،10،11،12،13،14،15. وهكذا، فإن التدريب وعدم الاستخدام يمثلان حافزا أساسيا لتعديل بعض خصائص NMJ، مثل حجمها وطولها وتشتت الحويصلات المتشابكة والمستقبلات، وكذلك محطةالأعصاب المتفرعة14و16و17و18و19و20.
وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن أي تغيير هيكلي أو انحطاط هذا التقاطع الحيوي يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا العصبية الحركية وضمور العضلات21. ويعتقد أيضا أن تغيير الاتصال بين الأعصاب والعضلات يمكن أن تكون مسؤولة عن التغيرات الفسيولوجية NMJ المرتبطة بالعمر وربما لتدميرها في الحالات المرضية. التفكيك تقاطع العصبية والعضلية يلعب دورا حاسما في بداية التصلب الجانبي الضموري (ALS), مرض تنكسي عصبي يشكل واحدا من أفضل الأمثلة على ضعف التفاعل بين العضلات والأعصاب3. على الرغم من العديد من الدراسات التي أجريت على خلل الخلايا العصبية الحركية, لا يزال موضع نقاش ما إذا كان التدهور لوحظ في ALS يحدث بسبب الضرر المباشر في الخلايا العصبية الحركية ومن ثم يمتد إلى توقعات القشرية الشوكي22; أو إذا كان ينبغي أن يعتبر اعتلال الاكسونوتاتي البعيدة حيث يبدأ الانحطاط في النهايات العصبية ويتقدم نحو الخلايا العصبية الحركية سوماس23,24. نظرا لتعقيد أمراض ALS ، فمن المنطقي النظر في حدوث مزيج من العمليات المستقلة. وبما أن NMJ هو اللاعب المركزي للتفاعل الفيزيولوجي بين العضلات والأعصاب ، فإن زعزعة استقراره تمثل نقطة محورية في أصل المرض الذي هو ذات صلة ليتم تحليلها.
يتم تنظيم نظام الثدييات العصبي العضلي وظيفيا في وحدات حركية منفصلة ، تتكون من خلية عصبية محركية وألياف العضلات التي يتم تنشيطها حصريا من خلال محطتها العصبية. كل وحدة المحرك والألياف مع خصائص هيكلية مماثلة أو متطابقةوظيفية 25. الخلايا العصبية الحركية التوظيف الانتقائي يسمح تحسين استجابة العضلات لمطالب وظيفية. الآن من الواضح أن عضلات الهيكل العظمي الثديية تتكون من أربعة أنواع مختلفة من الألياف. يتم تسمية بعض العضلات وفقا لخصائص نوع الألياف الأكثر وفرة. على سبيل المثال، السولوس (عضلة خلفية للطرف الخلفي المشاركة في الحفاظ على وضع الجسم) يحمل غالبية وحدات الارتعاش البطيء (النوع 1) ومعترف به كعضلات بطيئة. بدلا من ذلك، يتكون الطول الرقمي المموه (EDL) بشكل أساسي من وحدات ذات خصائص ارتعاش سريع مماثلة (ألياف من النوع 2) ويعرف باسم عضلة سريعة متخصصة في الحركات التدريجية اللازمة للحركة. وبعبارة أخرى، على الرغم من أن عضلات البالغين هي من البلاستيك في الطبيعة بسبب التأثيرات الهرمونية والعصبية، وتكوين الألياف يحدد القدرة على أداء أنشطة مختلفة، كما رأينا في الوحيد الذي يواجه النشاط المستمر منخفضة الكثافة وEDL الذي يظهر ارتعاش واحد أكثر سرعة. ترتبط الميزات الأخرى التي هي متغيرة بين أنواع مختلفة من ألياف العضلات لهيكلها (محتوى الميتوكوندريا، وتمديد reticulum الساركوبلازمي، سمك خط Z)، محتوى MYOSIN ATPase، وتكوين سلسلة ثقيلة myosin26،27،28،29.
بالنسبة للقوارض NMJs ، هناك اختلافات كبيرة بين العضلات28،29. كشفت التحليلات المورفومترية التي أجريت في سولوس وEDL من الفئران عن وجود علاقة إيجابية بين منطقة متشابك وقطر الألياف (أي أن منطقة متشابك في الألياف البطيئة الوحيدة أكبر مما كانت عليه في ألياف EDL السريعة) ولكن النسبة بين منطقة NMJ وحجم الألياف متشابهة في كلتا العضلتين30و31. أيضا، فيما يتعلق المحطات العصبية، كانت المناطق المطلقة endplate في ألياف النوع 1 أقل مما كانت عليه في ألياف النوع 2، في حين أن تطبيع قطر الألياف جعل مناطق من المحطات العصبية في نوع 1 الألياف أكبر32.
ومع ذلك، تركز دراسات قليلة جدا على التحليل المورفومتري لإظهار الأدلة على التغيرات في بعض مكونات NMJ33،34. وبالتالي ، نظرا لأهمية NMJ في وظيفة الكائن الحي ، الذي يتم تغيير مورفولوجيا وعلم وظائف الأعضاء في أمراض مختلفة ، من المهم تحسين بروتوكولات التشريح لأنواع مختلفة من العضلات بجودة كافية للسماح بتصور هيكل NMJ بأكمله. ومن الضروري أيضا لتقييم حدوث تغييرات قبل أو postynaptic في حالات تجريبية مختلفة أو ظروف مثل الشيخوخة أوممارسة 35،36،37،38. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من المفيد أن الأدلة على تعديلات أكثر دهاء في مكونات NMJ مثل الفوسفور العصبي المتغيرة في النهايات العصبية الطرفية كما ورد في ALS39.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل لتشريح اثنين من عضلات الهيكل العظمي الفئران (واحد بطيء الارتعاش والآخر سريع نشل)، عزل العضلات الألياف والكشف عن المناعة من علامات ما قبل وما بعد متشابك لتقييم كميا التغييرات NMJ فضلا عن عمليات التجميع / تفكيك. هذا النوع من البروتوكول يمكن أن تكون مفيدة في ن…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكرا جزيلا ل CSIC و PEDECIBA على الدعم المالي المقدم لهذا العمل. إلى ناتاليا روسانو لتصحيحاتها المخطوطة؛ إلى مارسيلو Casacuberta الذي يجعل الفيديو ونيكولاس بولاتو لإعارة صوته لذلك.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 – AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neurosciences. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neurosciences. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -. S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
