Detta dokument syftar till att presentera ett protokoll för att förbereda återvinning endosomer från däggdjursceller med hjälp av sackarosdensitet gradient ultracentrifugation.
Endosomal trafficking är en viktig cellulär process som reglerar ett brett spektrum av biologiska händelser. Proteiner internaliseras från plasmamembranet och transporteras sedan till de tidiga endosomerna. De internaliserade proteinerna kan överföras till lysosomen för nedbrytning eller återvinnas tillbaka till plasmamembranet. En robust endocytisk återvinningsväg krävs för att balansera avlägsnandet av membranmaterial från endocytos. Olika proteiner rapporteras reglera vägen, inklusive ADP-ribosyleringsfaktor 6 (ARF6). Densitetsgradient ultracentrifugation är en klassisk metod för cellfraktionering. Efter centrifugeringen sedimenteras organeller vid deras isopyniska yta. Bråktalen samlas in och används för andra nedströmstillämpningar. Beskrivs här är ett protokoll för att erhålla en återvinning endosome-innehållande fraktion från transfected däggdjursceller med densitet gradient ultracentrifugation. De isolerade fraktionerna utsattes för standard västerländsk blotting för att analysera deras proteininnehåll. Genom att använda denna metod identifierade vi att plasmamembranet inriktning på uppslukande och cellmotilitet 1 (ELMO1), en Ras-relaterade C3 botulinumtoxin substrat 1 (Rac1) guanin nukleotid utbyte faktor, är genom ARF6-medierad endocytic återvinning.
Endosomal trafficking är en viktig fysiologisk process som involverar olika biologiska händelser1, till exempel transport av signalreceptorer, jonkanaler och vidhäftningsmolekyler. Proteiner lokaliserade vid plasmamembranet internaliseras av endocytos2. De internaliserade proteinerna sorteras sedan efter den tidiga endosom3. Några av proteinerna är inriktade på lysosomer för nedbrytning4. En betydande mängd proteiner återvinns dock tillbaka till cellytan genom snabb återvinning och långsamma återvinningsprocesser. Vid snabb återvinning lämnar proteiner de tidiga endosomerna och återvänder direkt till plasmamembranet. Omvänt, i långsam återvinning, sorteras proteiner först till det endocytiska återvinningsutrymmet och transporteras sedan tillbaka till plasmamembranet. Olika lastproteiner, till exempel clathrin, retromerkomplex, retrieverkomplex och Wiskott-Aldrich syndromprotein och SCAR Homologue (WASH) komplex, deltar i sådana membranåtervinningsprocesser4,5,6,7,8,9. Balansen mellan endocytos och återvinningshändelse är avgörande för cellens överlevnad och bidrar till olika cellulära händelser10, till exempel cell vidhäftning, cellmigration, cellpolaritet och signaltransduktion.
ARF6, en liten GTPase, är en rapporterad regulator av endocytisk handel7,11,12. Av intresse har olika forskargrupper illustrerat vikten av ARF6 i endocytisk återvinning13,14,15,16,17. Studien syftar till att undersöka sambandet mellan ARF6-medierad neuritutväxt och endocytisk återvinning. Den tidigare rapporten tyder på att aktiveringen av ARF6 är uppströms till Rac1-aktivitet genom att agera på ELMO1-dedicator av cytokines 1 (DOCK180) komplex18. Hur ARF6 utlöser ELMO1-DOCK180 medierad Rac1-signalering är dock fortfarande oklart. Densitet gradient ultracentrifugation användes för att undersöka rollen av ARF6-medierad endocytic återvinning i en sådan process. Genom att använda det erhölls den återvinningsinnehållande fraktionen från cell lysates19. Fraktionen utsattes för western blotting för proteininnehållsanalys. Immunoblot resultaten visade att under förekomsten av FE65, en hjärnan-berikad adapter protein, aktiva ARF6 avsevärt ökade nivån av ELMO1 i återvinning endosome-innehållande fraktion. Följande protokoll omfattar förfaranden för 1) transfekterande däggdjursceller. 2. Förbereda proverna och densitetsgradientkolumnerna. och (3) erhållande av den återvinningshaltiga fraktionen.
Ovanstående protokoll beskriver förfarandena för att isolera återvinning endosomer från odlade celler genom ultracentrifugation. Tillförlitligheten hos denna metod har visats av den senaste publikationen22, som bevisar att återvinning endosomer framgångsrikt isoleras från andra organeller (figur 1), såsom Golgi-apparaten och mitokondrier. Vissa kritiska steg måste uppmärksammas för att få ett bra separationsresultat. Vid beredning av sackaroslösningarna…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av medel från Research Grants Council Hong Kong, CUHK direct grant scheme, United College endowment fund och TUYF Charitable Trust. Siffrorna i detta arbete anpassades från vår tidigare publikation, “ARF6-Rac1 signal-mediated neurit utväxt förstärks av neuronal adapter FE65 genom orkestrerande ARF6 och ELMO1” publicerad i FASEB Journal i oktober 2020.
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |