Ultracentrifugation à gradient de densité pour l’étude du recyclage endocytaire dans les cellules de mammifères

Résumé

Cet article vise à présenter un protocole de préparation d’endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose.

Résumé

Le trafic endosomal est un processus cellulaire essentiel qui régule un large éventail d’événements biologiques. Les protéines sont internalisées à partir de la membrane plasmique, puis transportées vers les premiers endosomes. Les protéines internalisées pourraient être transitées vers le lysosome pour être dégradées ou recyclées vers la membrane plasmique. Une voie de recyclage endocytaire robuste est nécessaire pour équilibrer l’élimination des matériaux membranaires de l’endocytose. Diverses protéines régulent la voie, y compris le facteur ADP-ribosylation 6 (ARF6). L’ultracentrifugation par gradient de densité est une méthode classique de fractionnement cellulaire. Après la centrifugation, les organites sont sédimentés à leur surface isopycnique. Les fractions sont collectées et utilisées pour d’autres applications en aval. Décrit ici est un protocole pour obtenir une fraction contenant des endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères transfectées en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité. Les fractions isolées ont été soumises à un transfert Western standard pour analyser leur teneur en protéines. En utilisant cette méthode, nous avons identifié que le ciblage de la membrane plasmique de l’engloutissement et de la motilité cellulaire 1 (ELMO1), un facteur d’échange de nucléotides de guanine substrat 1 de la toxine botulique C3 (Rac1) lié à Ras, se fait par recyclage endocytaire médié par ARF6.

Introduction

Le trafic endosomal est un processus physiologique essentiel qui implique divers événements biologiques^1,par exemple, le transport des récepteurs de signalisation, des canaux ioniques et des molécules d’adhésion. Les protéines localisées au niveau de la membrane plasmique sont internalisées par endocytose^2. Les protéines internalisées sont ensuite triées par l’endosome^{précoce 3.} Certaines des protéines sont ciblées sur les lysosomes pour la dégradation⁴. Cependant, une quantité importante de protéines est recyclée à la surface de la cellule par des processus de recyclage ra....

Protocole

1. Culture et transfection de cellules de mammifères

1. Plaque 2 x 10⁶ cellules dans un plat de culture de 100 mm. Utilisez quatre plats pour chaque transfection.
   REMARQUE : Le nombre de cellules requises peut varier selon les lignées cellulaires. L’optimisation peut être nécessaire avant de passer à l’étape d’isolement.
2. Le lendemain, transfectez les cellules avec de la lipofectamine selon les instructions du fabricant.

2. Récolte cellulaire

1. Jeter le milieu de culture 48 h après la transfection.
2. Lavez les cellules avec du PBS glacé (phosphates de sodium de 10 mM, chlorure de potassium....

Résultats

Après avoir fractionné les cellules HEK293 non transfectées par ultracentrifugation du gradient de densité, 12 fractions ont été collectées à partir du haut du gradient. Les fractions récoltées ont été diluées avec le tampon de dilution dans un rapport de 1:1 et soumises à une deuxième série de centrifugation. Les échantillons ont ensuite été soumis à un transfert Western pour analyser leur teneur en protéines. Comme le montre la figure 1,le marqueur d’endosomes de recyclage Rab11 est détect.......

Discussion

Le protocole ci-dessus décrit les procédures d’isolement des endosomes de recyclage des cellules cultivées par ultracentrifugation. La fiabilité de cette méthode a été démontrée par la dernière publication²², prouvant que les endosomes de recyclage sont isolés avec succès d’autres organites(Figure 1),tels que l’appareil de Golgi et les mitochondries. Certaines étapes critiques doivent être prises en compte pour obtenir un bon résultat de séparation. Lors de la prépara.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 ml, tube en polypropylène à paroi épaisse ouvert, 11 x 34 mm	Beckman Coulter	347287
100 mm Boîte de culture tissulaire	SPL	20100
13,2 mL, tube ultra-transparent à paroi mince à toit ouvert certifié libre, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	C14277
5x Tampon d’échantillon	GenScript	MB01015
Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA	Roche	11873580001
COX IV (3E11) Technologie	de signalisation cellulaire	4850S	Anticorps monoclonal de lapin pour la détection de COX IV.
Broyeur de tissus Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
Dounce, 7 mL	DWK Life Sciences	357542
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec faible teneur en glucose	HyClone	SH30021.01
Anticorps ELMO1 (B-7)	Santa Cruz Biotechnology	SC-271519	Anticorps monoclonal de souris pour la détection d’ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Anticorps FE65 (E-20)	Santa Cruz Biotechnology	SC-19751	Anticorps polyclonal de chèvre pour la détection de FE65.
Sérum fœtal de bovin,	HyClone	SV30160.03
Anticorps monoclonal GAPDH (6C5)	Ambion	AM4300	Anticorps monoclonal de souris pour la détection de GAPDH.
Logiciel ImageLab	Bio-Rad		Mesure de l’intensité de la bande
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Lipofectamine 2000 Réactif de transfection	Invitrogen	11668019
Anticorps monoclonal anti-&bêta ;-COP	Sigma	G6160	Anticorps monoclonal de souris pour la détection de &bêta ;-COP.
Myc-tag (9B11) souris mAb	Technologie de signalisation cellulaire	2276S	Anticorps monoclonal de souris pour la détection des protéines marquées myc.
OmniPur EDTA, sel disodique, dihydraté	Calbiochem	4010-OP
Optima L-100 XP	Beckman Coulter	392050
Optima MAX-TL	Beckman Coulter	A95761
Opti-MEM I Sérum réduit	Gibco	31985070
PBS Comprimés	Gibco	18912014
PhosSTOP	Roche
Anticorps polyclonal spécifique à 4906845001 RAB11A	Proteintech	20229-1-AP	Anticorps polyclonal de lapin pour la détection de Rab11.
Sucrose	Affymetrix	AAJ21931A4
SW 41 Ti	Beckman Soc	331362
TLA-120.2 Rotor à angle fixe	Beckman Soc	362046
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge phénol	Gibco	25300062

mAb de lapin de qualité recherche Rotor à godets oscillants