제시된 감마델타(γδ) T 세포 약품의 확장을 위한 프로토콜이다. 림프구는 졸레드로닉산 및 인터류신-2로 농축된 용류 및 γδ에 의해 분리된다. 알파 베타 T 세포는 임상 급 자기 분리 장치를 사용하여 고갈된다. γδ 세포는 K562 유래, 인공 항원 제시 세포와 공동 배양되고 확장된다.
Vγ9Vδ2 T 세포는 T 림프구의 사소한 하위 집합이지만, 이 인구는 주요 조직적합성 복합체(MHC)-독립적인 방식으로 항원을 인식하고 암 면역 요법에 이상적인 후보이기 쉬운 강력한 세포용 이펙터 기능을 개발하는 능력을 추구한다. 말초 혈액에서 감마 델타(γδ) T 세포의 저주파로 인해 급성 골수성 백혈병(AML)을 가진 환자에서 동종 γδ T 세포를 최초로 인간으로 사용하기 위한 고순수 γδ T 세포 약물 생성물을 크게 확장하는 효과적인 프로토콜을 개발했습니다. 건강한 기증자 아페레시스를 동종 세포 공급원으로 사용하여 림프구는 크기와 밀도로 세포를 분리하는 카운터플로우 원심분리 방법에 대한 검증된 장치를 사용하여 격리됩니다.
림프구가 풍부한 분획이 활용되고, γδ T 세포는 7일 동안 졸레드로닉산(FDA 승인) 및 인터류신(IL)-2로 우선적으로 활성화된다. γδ T 세포의 우대 적 확장에 따라, 임상 급 자기 세포 분리 장치 및 TCRαβ 구슬은 오염 T 세포 수용체 (TCR)αβ T 세포를 고갈하는 데 사용된다. 고농축 γδ T 세포는 다음 설계 인공 항원 제시 세포를 사용하여 두 번째 확장을 겪습니다 (aApCs) K562 세포에서 유래 한 유전자 조작 단일 연쇄 가변 단편을 표현하기 위해 유전자 조작 (scFv) CD3 및 CD28, 41BBL (CD137L) 및 IL15-RA-zoledronic 산 및 IL-2와 함께. aApC와 공동 배양에서 하루 종일 농축 된 γδ T 세포를 하루 종일 파종하면 건강한 기증자 혈액으로부터 >229,000 배의 평균 배 확장과 함께 고순수 γδ T 세포의 제조를 용이하게합니다.
백혈병 재발은 AML1,2,3를 가진 환자에서 조혈 세포 이식 (HCT) 후에 사망의 주요 한 원인입니다. 더 나은 백혈병 없는 생존은 접목 대 호스트 질병 (GVHD)4의 증가한 리스크 없이 HCT 후에 혈액 γδ T 세포의 증가한 복구로 보고되었습니다. γδ T 세포의 능력은 MHC 독립적 인 방식으로 항원을 인식하고 강한 세포 및 Th1 과 같은 이펙터 기능을 개발하여 T 세포의 이 경미한 하위 집단을 재발 위험에 처한 AML 환자의 치료에 이상적입니다5. Vγ9Vδ2 T 세포가 주변T 세포의 0.5%에서 5%에 이르는 T 림프구의 사소한 하위 집합이라는 점을 감안할 때, 우리는 임상 시험을 위한 잠재적으로 치료용량을 달성하기 위해 혈액 세포의 이 희소한 인구를 확장하는 견고한 시스템을 확립하기 시작했습니다.
다른 사람들은 졸레드로닉산과 심지어 aAPC를 사용하여 γδ T 세포를 성공적으로 확장했지만, 우리는 잠재적으로 229,749 배까지 γδ T 세포를 확장 할 수있는 프로세스를 개발했습니다. 팽창은 양면이다 : 첫째, 림프구는 분리 계측기를 사용하여 용광에 의해 얻어진다. 이 장비는 카운터플로우 원심분리에 의한 크기, 모양 및 밀도에 따라 셀을 분리할 수 있는 폐쇄 시스템을 제공합니다. 림프구를 농축한 후, Vγ9Vδ2 T 세포의 선택적 팽창은 7일 동안 졸레드로닉산 및 IL-2로 처리함으로써 달성된다. 이 치료 직후, TCR-αβ T 세포는 미생물 기술을 사용하여 고갈되어 K562 유래 aApC를 사용하여 γδ T 세포의 후속 확장을 허용합니다.
공정 검증을 위해, × 106 개의 졸레드로닉산 확장γδ T 세포만이 aApC를 이용한 상2 공동배양 확장을 위해 사용되었다. 이 확장 단계에서, γδ T 세포는 Moffitt에서 제조된 K562-CD3-41BBL(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)의 현재 양호한 제조 관행(cGMP)-호환 작업 세포 은행(WCB)을 사용하여 활성화된다. 이러한 biphasic 확장의 근거는 단세포에서 파네실 디포스페이트 신타제(FDPS)를 억제하는 조레드로닉산의 능력에 기초하여, Vγ2Vδ2 세포를 직접 자극하는 이스토닐 파이로포스페이트의 축적으로 이어진다. 확장의 두 번째 단계에서 K562 유래 aApC(K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)는 모든 T 셀에 강력한 자극을 제공한다. 그러나, 세포 생성물은 이미 γδ T 세포를 위해 농축되어, γδ T 세포의 견고한 팽창을 초래한다.
특정 장비와 플라스크를 사용하면 이 공정이 기능적으로 폐쇄되어 오염 위험이 줄어듭니다. 또한, 1L 폐쇄시스템 생물반응기는 수유를 위한 최소한의 필요를 가지고 총 1L의 배지에서 세포의 최대 성장과 확장을 용이하게 한다. Moffitt 방법의 장점은 동종 투여를 위한 매우 순수한 기증자 유래 γδ T 세포 제품을 생산하기 위해 신속하고 재현 가능하며 매우 실현 가능한 GMP 시스템을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 부분적이고 완전한 면제가 있는 암 환자의 미생물 및 종양에 대한 면역을 중재하기 위해 Vγ2Vδ2 T 세포 수용체를 채택 면역 요법으로 발현하는 인간 γδ T 세포를 사용하는 것을 목표로 하는 모든 임상 시험에 적용될 수 있다. 또한, γδ 키메라 항원 수용체 양성(CAR+) T 세포의 개발 및 생산을 위한 견고한 플랫폼을 제공한다.
Moffit 세포 치료 연구소는 임상 시험에서 DP로 사용하기 위해 고순수 γδ T 세포의 양면 확장을 가진 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 zoledronic 산 및 WCB aAPC에 의해 성공적으로 활성화되고 확장되는 고순수γδ T 세포 DP를 산출하는 폐쇄 된 시스템에서 cGMP 지침에 따라 제조 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 AML 환자를 위한 동종 γδ T 세포 DP의 제조를 위한 FDA에 의해 승인되었습니다. 건강한 기증자를 사용하여, 우리는 성공적으로 기증자 γδ T 세포의 작은 인구를 7 일 만에 확장 2.06 ± 0.45% 에 54.45 ± 28.34%. 졸레드로닉산으로 7일 간 확장된 후, 기증자 2가 NK 인구가 증가한 것으로 관찰되었다.
졸드로닉산은 단세포에서 파네실 디포스페이트 신타제(FDPS)를 억제하며, 이는 차례로 T 세포및 천연 NK 세포의 증식의 현저한 증가와 상관관계가 있는 이스토펜텐닐 파이로포산염(IPP)의 축적으로 이어진다. 이러한 증가된 NK 인구는 aAPC가 NK 세포의 추가 확장에기여할 것이기 때문에 aAPC와의 2단계 확장을 방해합니다. 이러한 이유로, 기증자 기준은 높은 NK 인구를 가진 기증자를 제외하기 위하여 수정되었습니다. αβ T 세포의 고갈 후, γδ T 세포는 27.51%± 76.61로 더욱 농축되었다. 이러한 독특한 프로토콜은 γδ T 세포내CD8, CD28 및 CD127L 수용체를 대상으로 Moffit 제조 aApC를 활용하는 제2 확장을 포함한다. aApC를 가진 이 두 번째 확장 단계는 CD3+TCR γδ+ T 세포에 대해 ≥65%, ≤1% TCRαβ T, 및 <3-CD16+CD56+ NK 셀에 대해 DP를 산출하였다. K562 유래 aAPC의 사용으로 인해 이러한 aAPC가 최종 제품의 <1%로 구성되어 있음을 입증할 필요가 있었습니다.
Moffit CTF는 최종 DP에서 잔류 K562 세포의 백분율을 측정하기 위해 방출 기준에 사용되는 유동 세포 분석법을 개발했습니다. 이러한 흐름 세포 분석은 K562 세포를 식별하기 위해 세포 표면 항원활용의 모든 문제를 완화한다. 활성화된 T 세포가 CD71을 발현할 수 있으므로 CD3-CD56 및 CD16–인구에 게이팅한 다음 전적으로 K562 세포인 CD71+ 셀을 검사하여 모든 T 세포와 NK 세포를 배제하는 전략을 고안했습니다. 이 프로토콜은 γδ T 세포 DP가 잔류 K562 세포의 0.48 ± 0.42%를 산출하고 ≥70% 생존율, PCR에 의한 마이코플라즈마 부정성, 그램 염색에 의해 본 유기체, ≤2 EU/mL 내독신의 EU/mL, 그리고 최종 성장(14일) 혈액멸을 입증한다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 이 프로토콜 발달을 위한 자금을 제공하기 위한 Moffitt 암 센터에서 세포 면역 요법-조사자 개시 시험 상 교내 자금 조달 기회에 감사를 드립니다. 클라우디오 아나세티 박사의 귀중한 도움과 지도에 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 원고에 대한 그의 통찰력과 검토에 대한 박사 저스틴 바우처에게 감사드립니다.
Hanks Balanced Salt Solution | R&D | 285-GMP | |
Human Albumin 25% | Grifolis | 65483-16-071 | |
Plasmalyte A | Fisher | 2B2543Q | |
Zoledronic Acid (Zometa) | Hos pira | 4215-04–8 | FDA approved drug |
DMSO | WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH | WAK-DMSO-10 | |
CS10 | BIOLIFE SOLUTIONS | 210374 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
10 mL syringe | BD | 309604 | |
20 mL syringe | BD | 302830 | |
50 mL syringe | BD | 309653 | |
100 mL syringe | JMS | 992861 | |
18g Needle | Fisher | 305198 | |
Cryovials 1.8 mL | Fisher | 375418 | |
5 mL pipette | Fisher | 1367811D | |
50 mL pipette | Fisher | 1367610Q | |
10 mL pipette | Fisher | 1367811E | |
100 mL pipette | Fisher | 07-200-620 | |
15 mL conical | Fisher | 05-539-12 | |
50 mL conical | Fisher | 05-539-7 | |
250 mL conical | Fisher | 430776 | |
600 mL Transfer Pack | TERUMO BCT INC | 1BBT060CB71 | |
4" Plasma Transfer Set | INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES | 03-220-90 | |
Elutra Tubing Set | TerumoBCT | 70800 | |
100 MCS GREX | WILSON WOLF MFG CORP | 81100-CS | |
Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system | Fisher Scientific | 22-246660 | |
Acacia Pump boot | MPS Medical In | 17789HP3MLL | |
CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec Inc | 130-070-525 | |
Dornase Alpha | Genentech, Inc | 50242-100-40/186-0055 | FDA approved drug |
1000 mL 0.22 um Filter | Fisher | 157-0020 | |
Blood Filter 170um | B.Braun | V2500 | |
CliniMACs Tubing set | Miltenyi Biotec Inc | 130-090-719 | |
CliniMACS TCRα/β Kit | Miltenyi Biotec Inc | 130-021-301 | |
Y-Type blood set | Fenwal | FWL4C2498H | |
75 mL Flask | Fisher | 430641U | |
IL-2 | Prometheus | 65483-116-071 | FDA approved drug |
AIM-V | Fisher | 0870112BK | |
Human AB serum | Gemini Bio-Product | 100H41T | |
3 Liter Transfer pack | Independent Medical Associates | T3109 | |
1000 pipette tips | Fisher Scientific | 5991040 | |
CF-250 | KOLBio | CF-250 | |
Elutra | TERUMOBCT | ||
CliniMACS | Miltenyi Biotec Inc | ||
GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump | WILSON WOLF MFG CORP | ||
HERAcell Vios CO2 Incubator | Thermo Scientific |