Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

Summary

Presentato è un protocollo per l’espansione del prodotto farmaceutico a cellule T Gamma-Delta (γδ). I linfociti sono isolati per elutriazione e arricchiti con acido zoledronico e interleuchina-2. Le cellule T alfa-beta vengono esaurite utilizzando un dispositivo di separazione magnetica di grado clinico. Le cellule γδ sono co-coltivate con cellule derivate da K562, che presentano antigeni artificiali ed espanse.

Abstract

Sebbene le cellule T Vγ9Vδ2 siano un sottoinsieme minore di linfociti T, questa popolazione è ricercata per la sua capacità di riconoscere gli antigeni in modo indipendente dal complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) e sviluppare una forte funzione effettore citolitica che la rende un candidato ideale per l’immunoterapia del cancro. A causa della bassa frequenza delle cellule T Gamma-Delta (γδ) nel sangue periferico, abbiamo sviluppato un protocollo efficace per espandere notevolmente un prodotto farmacologico altamente puro per le cellule T γδ per l’uso primo nell’uomo di cellule T γδ allogeniche in pazienti con leucemia mieloide acuta (LMA). Utilizzando l’aferesi di un donatore sano come fonte di cellule allogeniche, i linfociti vengono isolati utilizzando un dispositivo convalidato per un metodo di centrifugazione controcorrente per separare le cellule per dimensione e densità.

Viene utilizzata la frazione ricca di linfociti e le cellule T γδ vengono attivate preferenzialmente con acido zoledronico (approvato dalla FDA) e interleuchina (IL)-2 per 7 giorni. A seguito dell’espansione preferenziale delle cellule T γδ, un dispositivo di separazione cellulare magnetico di grado clinico e perline TCRαβ vengono utilizzati per esaurire le cellule T contaminanti del recettore delle cellule T (TCR)αβ. Le cellule T γδ altamente arricchite subiscono quindi una seconda espansione utilizzando cellule artificiali ingegnerizzate che presentano l’antigene (aAPC) derivate da cellule K562 geneticamente modificate per esprimere frammenti variabili a catena singola (scFv) per CD3 e CD28, 41BBL (CD137L) e IL15-RA insieme all’acido zoledronico e IL-2. La semina di cellule T γδ arricchite per tutto il giorno 7 in co-coltura con le aAPC facilita la produzione di cellule T γδ altamente pure con un’espansione media di >229.000 volte dal sangue di un donatore sano.

Introduction

La recidiva di leucemia è la principale causa di mortalità dopo trapianto di cellule ematopoietiche (HCT) in pazienti con LMA1,2,3. Una migliore sopravvivenza libera da leucemia è stata riportata con l’aumento del recupero delle cellule T γδ nel sangue dopo HCT senza aumento del rischio di graft-versus-host disease (GVHD)⁴. La capacità delle cellule T γδ di riconoscere gli antigeni in modo indipendente dall’MHC e di sviluppare forti funzioni effettrici citolitiche e simili a Th1 rendono questa sottopopolazione minore di cellule T ideale per il trattamento dei pazienti affetti da LMA sottoposti a trapianto allogenico a rischio di ^recidiva5. Dato che le cellule T Vγ9Vδ2 sono un sottoinsieme minore di linfociti T che vanno dallo 0,5% al 5% delle cellule T nella ^periferia6, abbiamo deciso di stabilire un sistema robusto per espandere questa rara popolazione di cellule del sangue per ottenere dosi potenzialmente terapeutiche per studi clinici.

Sebbene altri abbiano espanso con successo le cellule T γδ usando acido zoledronico e persino aAPC, abbiamo sviluppato un processo che può potenzialmente espandere le cellule T γδ di 229.749 volte. L’espansione è bifasica: in primo luogo, i linfociti sono ottenuti per elutrazione utilizzando lo strumento di separazione. L’apparecchiatura fornisce un sistema chiuso che consente la separazione delle celle in base alle loro dimensioni, forma e densità mediante centrifugazione controcorrente. Dopo l’arricchimento per i linfociti, l’espansione selettiva delle cellule T Vγ9Vδ2 si ottiene mediante trattamento con acido zoledronico e IL-2 per 7 giorni. Immediatamente dopo questo trattamento, le cellule T TCR-αβ vengono esaurite utilizzando la tecnologia delle microsfere, consentendo la successiva espansione delle cellule T γδ con aAPC derivate da K562.

Per la validazione del processo, solo 5 × 106 cellule T γδ espanse con acido zoledronico sono state utilizzate solo 5 × ¹⁰⁶ cellule T γδ espanse con aAPC. In questa seconda fase di espansione, le cellule T γδ vengono attivate utilizzando una banca di cellule di lavoro (WCB) conforme alle good manufacturing practices (cGMP) di aAPC derivate da K562 geneticamente modificate (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) prodotte a Moffitt. Il razionale di questa espansione bifasica si basa sulla capacità dell’acido zoledronico di inibire la farnesil difosfato sintasi (FDPS) nei monociti, portando all’accumulo di isopentenil pirofosfato, che stimola direttamente le cellule Vγ2Vδ2. Nella seconda fase di espansione, le aAPC derivate da K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) forniscono una robusta stimolazione a tutte le cellule T. Tuttavia, il prodotto cellulare è già stato arricchito per le cellule T γδ, con conseguente robusta espansione delle cellule T γδ.

Con l’uso di attrezzature e palloni specifici, il processo è un sistema funzionalmente chiuso, diminuendo così il rischio di contaminazione. Inoltre, il bioreattore a sistema chiuso da 1 L facilita la massima crescita ed espansione delle cellule in un volume totale di 1 L di mezzo con un minimo bisogno di alimentazione. Il vantaggio del metodo Moffitt è che fornisce un sistema GMP rapido, riproducibile e altamente fattibile per produrre un prodotto a base di cellule T γδ altamente puro, derivato da donatori, per la somministrazione allogenica. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi studio clinico che mira a utilizzare cellule T γδ umane che esprimono recettori delle cellule T Vγ2Vδ2 come immunoterapia adottiva per mediare l’immunità contro microbi e tumori in pazienti oncologici con remissione parziale e completa. Inoltre, fornisce una solida piattaforma per lo sviluppo e la produzione di cellule T positive al recettore dell’antigene γδ chimerico (CAR⁺).

Protocol

NOTA: è stata ottenuta l’approvazione dell’IRB e il consenso informato è stato ottenuto dai donatori. 1. Isolamento dei linfociti Trasferire il prodotto di aferesi in una camera bianca.NOTA: la convalida del processo è stata eseguita utilizzando la normale aferesi del donatore da un fornitore commerciale esterno conforme alle normative sulla raccolta delle materie prime cellulari. Raccogliere campioni per test di sterilità, conteggio cellulare e fenotipizzazione cellulare. Elutriato sul dispositivo di centrifugazione controcorrente utilizzando un mezzo primario di Hanks Balanced Salt Solution con albumina sierica umana all’1% (HSA) e un mezzo secondario di soluzione salina (0,9% di cloruro di sodio injection USP) o soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Impostare la velocità di centrifugazione di elutrazione a 900 × g e raccogliere frazioni in base alla portata e al tempo. Raccogliere campioni dalla frazione 2 ed eseguire i seguenti test: 2 ml per test di sterilità; 0,5 mL per la conta cellulare e la vitalità con acridina arancio/ioduro di propidio (AO/PI); 5 × 106 cellule per la fenotipizzazione cellulare mediante citometria a flusso. Espandere una frazione linfocitaria pura (frazione 2) di cellule in coltura a 10 × 106 cellule/cm2 in un bioreattore a sistema chiuso da 1 L con 5 μmol/L di acido zoledronico e 300 UI/mL di IL-2. Incubare per sette giorni in un incubatore impostato a 37 °C con il 5% di CO2. 2. Deplezione delle cellule T alfa-beta (αβ) Raccogliere le cellule dal pallone del bioreattore a sistema chiuso da 1 L. Saldare sterili un pacco di trasferimento da 1 L alla linea rossa del bioreattore a sistema chiuso e utilizzare la pompa farmaceutica appropriata per trasferire le cellule nel pacchetto di trasferimento. Prelevare i seguenti campioni: 10 ml per sterilità media esaurita; 0,5 mL di cellule per la conta e la vitalità delle cellule utilizzando AO/PI; 5 × 106 cellule per citometria a flusso Risospese le cellule a ~ 5 × 108 cellule / mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o (PBS / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) tampone + 0,5% HSA e anticorpo biotinilato TCR αβ-specifico. Mettere lo shaker in frigorifero e incubare le cellule a 2-8 °C per circa 15 minuti con agitazione. Lavare le celle con un totale di 600 ml di tampone PBS/EDTA + 0,5% HSA. Centrifugare per rimuovere l’anticorpo non legato a 200-500 × g per 15 minuti a 2-8 °C. Risospeso ~ 5 × 108 cellule / mL in tampone PBS / EDTA + 0,5% HSA con microsfere anti-biotina-specifiche (7,5 mL / 1 fiala). Mettere lo shaker in frigorifero e incubare le cellule a 2-8 °C per circa 15 minuti con agitazione. Dopo l’incubazione, centrifugare le cellule a 200-500 × g per 15 minuti a 2-8 °C per rimuovere le microsfere non legate. Sospendere ~ 6 × 107 celle / mL nel tampone PBS / EDTA + 0,5% HSA e trasferirle in un sacchetto di trasferimento. Installare il set di tubi nel dispositivo di separazione delle celle magnetiche di grado clinico seguendo le istruzioni del produttore, posizionare le confezioni con il tampone PBS/EDTA e la confezione di trasferimento con il prodotto cellulare nello strumento e puntarlo quando indicato dallo strumento. Selezionare il protocollo Depletion 1.2 per l’esaurimento delle cellule T αβ etichettate. Centrifugare la frazione bersaglio (cellule T γδ arricchite) e risospescere le cellule in mezzo integrato con il 10% di siero AB umano. Prelevare un campione da 0,5 ml ed eseguire un conteggio delle cellule e la vitalità con la colorazione AO/PI. Portare le cellule ad una concentrazione finale di circa 1 × 106 cellule/ml. Prelevare un campione di 5 × 106 cellule del prodotto per la fenotipizzazione della citometria a flusso post-esaurimento. 3. Co-cultura con aAPC Irradiare 5 × 107 aAPC/pallone a 100 Gy sullo strumento di generazione di raggi X. Utilizzare le aAPC in co-coltura con un rapporto 10:1 con le cellule T γδ. Porre le cellule AAPC irradiate (5 × 107 cellule/pallone) e le cellule T γδ (5 × 106 cellule/pallone) in palloni bioreattori a sistema chiuso da 1 L con 1 L di terreno di coltura integrato con siero AB umano al 10%. Semina fino a 10 boccette. Espandere le cellule in coltura per 10 giorni in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2. Monitorare i livelli di glucosio e lattato ogni 3-4 giorni utilizzando strisce, glucosio e un misuratore di lattato. Se il glucosio scende a 250 mg/dL, ridurre il volume nel matraccio a 200 ml utilizzando una pompa farmaceutica saldando a sterili una confezione di trasferimento da 1 L sulla linea rossa del bioreattore a sistema chiuso. Mescolare le cellule nei restanti 200 ml e prelevare un campione da 0,5 ml per il conteggio delle cellule e la misurazione della vitalità mediante colorazione AO-PI. Se il numero di cellule è ≥109, dividere un matraccio in due palloni e riempire ciascun matraccio fino a 1 L con AIM-V integrato con siero AB umano al 10%. Se il numero di cellule è <109, nutrire le cellule con un litro fresco di terreno di coltura integrato con il 10% di siero AB umano. Ripetere il passaggio 3.6 per tutti i palloni e restituirli all’incubatore a 37 °C e al 5% di CO2. Ripetere i passaggi 3.4-3.7 ogni 3 o 4 giorni. 4. Raccolta delle cellule Alla fine di 10 giorni in co-coltura, raccogliere tutte le fiasche del bioreattore. Raccogliere 1 pallone bioreattore alla volta e raggruppare tutte le cellule in un pacchetto di trasferimento di dimensioni appropriate. Saldare sterilemente il pacchetto di trasferimento alla linea rossa del bioreattore a sistema chiuso e utilizzare la pompa farmaceutica per trasferire le cellule nel pacchetto di trasferimento. Rimuovere i seguenti campioni di controllo qualità: 1% del prodotto farmaceutico (DP) per la sterilità mediante emocoltura e colorazione del grammo; 0,5 mL per il conteggio e la vitalità delle cellule utilizzando AO/PI; 5-10 × 106 cellule per la citometria a flusso (vedi Figura 1 per la strategia di gating); 0,5 ml per endotossina; 0,5 ml per la colorazione dei grammi; 106 cellule sono entrate in 10 ml di terreno esaurito per il test del micoplasma. Centrifugare le celle a 200-500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Lavare le celle in una soluzione di soluzione cristallina bilanciata + 0,5% HSA a 200-500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente. Risospenderli in un volume target di 100-300 ml di soluzione cristallina bilanciata + 0,5% HSA. 5. Test di rilascio Eseguire test di controllo qualità della cellula T γδ DP per quanto segue: purezza e identità mediante citometria a flusso (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); vitalità mediante colorazione AO/PI; endotossina; Test del micoplasma mediante reazione a catena della polimerasi (PCR); sterilità mediante colorazione al grammo e emocoltura aerobica e anaerobica; saggio K562 residuo mediante citometria a flusso (CD3-CD16-CD56-CD71+).

Representative Results

Il processo delle cellule T γδ è stato caratterizzato e ottimizzato per la produzione del prodotto farmaceutico a cellule T γδ. L’ottimizzazione del processo ha incluso 1) arricchimento dei linfociti mediante elutriazione, 2) espansione specifica delle cellule T (DS) della sostanza farmaceutica delle cellule T γδ con acido zoledronico, 3) deplezione delle cellule T γδ DS di TCRαβ, 4) espansione secondaria della cellula T γδ DS utilizzando aAPC derivate da K562 e 5) raccolta DP finale e formulazione del prodotto per somministrazione o crioconservazione. Dopo l’ottimizzazione del processo, le prove di conferma sono state eseguite su larga scala utilizzando il materiale derivato da tre donatori sani per confermare l’idoneità all’elaborazione cellulare. Tutti i dati sono stati analizzati e sono riassunti nella Tabella 1, tabella 2 e tabella 3. Le cellule separate dalla frazione di centrifugazione post-controflusso 2 (F2) hanno prodotto una popolazione di linfociti puri con una media del 99,23% di cellule CD45+ (riportata come frequenza del gate vivo totale) e un’eccellente vitalità media del 95,80% (Tabella 1). L’espansione specifica delle cellule T γδ con acido zoledronico dipendeva dalla percentuale iniziale di cellule natural killer (NK) presenti nella frazione linfocitaria (F2) dopo l’elutrazione. L’arricchimento della cellula T γδ DS con la deplezione di TCRαβ è stato coerente (Tabella 2). Le cellule T γδ DP prodotte da tre donatori sani avevano una media dello 0,11% ± 0,05% di cellule CD20+ B e dello 0,00% ± 0,00% di cellule TCR αβ+, soddisfacendo così il criterio di rilascio di ≤1% delle cellule T TCR αβ+. La percentuale media di celle NK nel prodotto finale è del 17,06% ± del 26,19% e soddisfa il criterio di rilascio del <35%. Inoltre, la percentuale media di cellule T e cellule NK negative al lignaggio nel prodotto finale è stata dello 0,48% ± dello 0,42% (Tabella 3). La colorazione della superficie cellulare e l’analisi citometrica a flusso sono state utilizzate per caratterizzare l’identità, la purezza e le impurità di processo del DS e del DP, come mostrato nella Figura 2A-D. L’espansione secondaria, ottenuta dalla co-coltura delle cellule T AAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB e γδ T cell DS con un rapporto di 10:1, ha generato un DP della cellula T γδ che soddisfaceva tutti i criteri di rilascio, come mostrato nella Tabella 4. Inoltre, le cellule sono state colorate e valutate mediante citometria a flusso alle cellule F2 di centrifugazione controcorrente del giorno 0, cellule T espanse dell’acido zoledronico del giorno 7, deplezione delle cellule T del giorno 7-TCR αβ, DP del giorno 17-finale per i seguenti biomarcatori cluster di differenziazione (CD)3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, recettore delle chemochine CC 7 (CCR7), proteina di morte cellulare programmata-1 (PD-1), la proteina 4 associata ai linfociti T citotossici (CTLA4), il gene 3 attivante i linfociti (LAG3) e l’immunoglobulina delle cellule T e la proteina 3 contenente il dominio della mucina (TIM3). I dati mostrati nella Figura 3 sono mediati da tre cicli indipendenti e dimostrano che le cellule non hanno raggiunto l’esaurimento. Il CTF Moffitt ha anche sviluppato un test K562 residuo per determinare le impurità DP correlate alle aAPC derivate da K562 (Figura 4). La strategia di gating citometrico a flusso utilizzata per caratterizzare le percentuali dei tipi cellulari è stata la seguente: 1) gating su popolazione negativa al lignaggio delle cellule T e NK (CD3-CD56-CD16-); 2) gate su CD71+ (recettore della transferrina espresso in lignaggio eritroide e LMA che consente il rilevamento di cellule K562 residue). Questa strategia di gating ha permesso la valutazione delle cellule CD3-CD16-CD56-CD71+, che sono l’aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (definito “K562 residuo” nella Figura 4). Questo gating consente l’enumerazione del K562 residuo nel DP finale moltiplicando la frequenza del K562 residuo per il conteggio totale vitale (TVC) del DP (71+ × DP TVC = Celle K562 residue nel DP). Tutti i dati citometrici a flusso sono riportati come la frequenza delle cellule vive. La Tabella 5 e la Figura 4 forniscono le percentuali di cellule T e cellule NK negative e di cellule K562 residue. È stato eseguito un t-test a due code per determinare la significatività statistica delle differenze tra queste popolazioni e ha rivelato che vi era una differenza significativa tra WCB e γδ T cell DP e tra WCB e γδ T cells (t = 0,0019 per T cell e NK cellline-negative; t < 0,0001 per il residuo K562 e t = 0,0314 per le cellule T e le cellule NK negative; t < 0,0001 per il K562 residuo) (tabella 5). Figura 1: Rappresentazione schematica della strategia di gating citometrico a flusso. Abbreviazioni: aAPC = , cellula artificiale che presenta l’antigene; SSC-A = area di dispersione laterale del picco; FSC-A = area di dispersione in avanti del picco; SSC-H = altezza di dispersione laterale del picco; FSC-H = altezza di dispersione in avanti del picco; CD = cluster di differenziazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Composizione del materiale di partenza, degli intermedi e del prodotto farmaceutico finale. Tutti i dati mostrati sono mediati da tre esecuzioni indipendenti. (A) L’aferesi di donatori sani subisce l’elutrazione utilizzando il dispositivo di centrifugazione controcorrente, con conseguente F2 (frazione ricca di linfociti), che viene utilizzata come materiale di partenza. (B) F2 subisce un’espansione specifica delle cellule T Vγ9Vδ2 per 7 giorni con 5 μmol/L di acido zoledronico e 300 UI/mL di IL-2 in 1 L di mezzo integrato con il 10% di siero AB umano. (C) La deplezione delle cellule TCR αβ delle cellule T viene eseguita sul prodotto espanso con acido zoledronico. (D) Un prodotto farmaceutico a cellule T γδ altamente puro viene raccolto dopo una seconda espansione di 10 giorni con aAPC irradiate in un rapporto 1:10 con 5 μmol/L di acido zoledronico e 300 UI/mL di IL-2 in 1 L di mezzo integrato con il 10% di siero AB umano. Abbreviazioni: NK = natural killer; CD = cluster di differenziazione; TCR= recettore delle cellule T; IL = interleuchina; aAPC = cellule artificiali che presentano l’antigene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Biomarcatori di materiale di partenza, intermedi e prodotto farmaceutico finale. Le cellule vengono raccolte e colorate per CD3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CCR7, PD-1, CTLA4, LAG3 e TIM3 alle cellule F2 della centrifugazione del giorno 0-controcorrente, cellule T espanse dell’acido zoledronico del giorno 7, deplezione delle cellule T del giorno 7-TCR αβ, prodotto farmacologico finale del giorno 17. Tutti i dati mostrati sono mediati da tre esecuzioni indipendenti. (A) Stem-like (CD3+, TCR γδ+, CD45RA+, CD45RO- e CCR7+) mostrato come un numero totale di cellule vive. (B) Memoria centrale (CD3+, TCR γδ+, CD45RA-, CD45RO+ e CCR7+) rappresentata come percentuale di cellule CD3+ TCR γδ+ . Abbreviazioni: CD = cluster di differenziazione; TCR= recettore delle cellule T; IL = interleuchina; . CCR7 = recettore delle chemochine CC 7; PD-1 = proteina di morte cellulare programmata-1; CTLA4 = proteina 4 citotossica associata ai linfociti T; LAG3 = gene 3 attivante i linfociti; TIM3 = immunoglobuline a cellule T e proteina 3 contenente dominio della mucina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Dati rappresentativi di un saggio residuo K562 (CD3-CD16-CD56-CD71+). Abbreviazioni: aAPC = cellula artificiale che presenta l’antigene; NK = cellula natural killer; SSC-A = area di dispersione laterale del picco; CD = cluster di differenziazione; IL = interleuchina; TCR = recettore delle cellule T; MCB = banca di celle master; FMO = fluorescenza meno uno; DP = prodotto farmaceutico; WCB = banca di celle funzionanti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Fasi del processo Parametri Donatori Nella media San Dev. Corsa 1 Corsa 2 Corsa 3 Post-arricchimento (frazione linfocitaria F2) TVC All Process Validations è stato seminato a 109 TVC 1,00 X 109 1,00 X 109 1,00 X 109 1,00 X 109 0.00 Vitalità (%) 98.6 96.6 92.2 95.8 3.27 Cellule B CD20+ (%) 15.6 23.4 15.2 18.07 4.62 Cd3+ cellule T (%) 80.04 66.7 76.1 74.28 6.85 TCR αβ+ (%) 77.59 58.03 68.96 68.19 9.8 TCR γδ+ (%) 2.48 1.59 2.1 2.06 0.45 Cellule NK CD3-CD56+CD16+ (%) 6.57 19.4 10.5 12.16 6.57 Cellula T e lignaggio delle cellule NK negativo (%) 13 13.7 13.4 13.37 0.35 Tabella 1: Riassunto dell’arricchimento dei linfociti mediante elutrazione riportato come frequenza di cellule vive. Abbreviazioni: TVC = conteggio totale vitale; TCR = recettore delle cellule T; CD = cluster di differenziazione; NK = cellula natural killer. Fasi del processo Parametri Donatori Nella media San Dev. Corsa 1 Corsa 2 Corsa 3 Espansione dell’acido zoledronico di 7 giorni (deplezione pre-TCRαβ) TVC · 3,69 x 109 1,79 X 109 1,42 X 109 2,3 X 109 1,22 X 109 Vitalità (%) 99.2 82.6 89.8 90.53 8.32 Cellule B CD20+ 2.1 11.5 7.08 6.89 4.7 Cd3+ cellule T (%) 95.7 64.1 91.9 83.9 17.25 TCR αβ+ (%) 13.88 38.14 31.98 28 12.61 TCR γδ+ (%) 81.44 24.93 56.98 54.45 28.34 Cellule NK CD3-CD56+CD16+ (%) 3.59 33.1 7.28 14.66 16.08 Cellula T e lignaggio delle cellule NK negativo (%) 0.67 2.7 0.82 1.4 1.13 Deplezione post-TCRαβ TVC · 1,81 x 109 4,95 x 108 3,80 x 108 8,95 X108 7,94 x 108 Vitalità cellulare (%) 98.8 87.6 89.8 92.07 5.93 Cellule B CD20+ 2.26 12 6.59 6.95 4.88 Cd3+ cellule T (%) 95.8 45.3 89.7 76.93 27.56 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0.001 0.001 0.001 TCR γδ+ (%) 95.61 45.07 89.16 76.61 27.51 Cellule NK CD3-CD56+CD16+ (%) 3.85 59.9 9.79 24.51 30.79 Cellula T e lignaggio delle cellule NK negativo (%) 0.34 1.72 0.45 0.84 0.77 TCR αβ+ TVC 0.00 4,95 x 103 3,8 X 103 2,92 X 103 2,59 x 103 TCR γδ+ TVC 1,73 x 109 2,23 x 108 3,39 X 108 7,64 x 108 8,39 x 108 CD3-CD56 + CD16 + NK TVC 6,97 x 107 2,97 x 108 3,72E+07 1,35 x 108 1,42 x 108 Tabella 2: Riassunto dell’espansione delle cellule T γδ con acido zoledronico e arricchimento dello strumento riportato come frequenza delle cellule vive. Abbreviazioni:TVC = conteggio totale vitale; TCR = recettore delle cellule T; CD = cluster di differenziazione; NK = cellula natural killer. Attributi del prodotto Parametri Donatori Nella media San Dev. Corsa 1 Corsa 2 Corsa 3 Giorno 0 γδ Cellule T 2,48 x 107 1,59 X 107 2,10 X 107 2,06 x 107 4,47 x 107 Giorno 7 post arricchimento γδ Cellule T 1,73 x 109 2,23 x 108 3,39 X 108 7,64 x 108 8,39 x 108 Espansione della piega al giorno 7 69.76 14.03 16.14 33.31 31.58 TVC alla vendemmia* 8,14 x 1010 1,67 X 1010 6,84 x 1010 5,55 x 1010 3,42 x 1010 Vitalità cellulare (%) 92.8 85.5 87.3 88.53 3.80 Cellule B CD20+ (%) 0.12 0.06 0.15 0.11 0.05 Cd3+ cellule T (%) 97.8 52 97.5 82.43 26.36 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0 0.00 0.00 TCR γδ+ (%) 97.51 50.13 97.21 81.62 27.27 Cellule NK CD3-CD56+CD16+ (%) 2.16 47.3 1.71 17.06 26.19 Negativo per la linea cellulare T e NK, CD71+ Residuo K562 (%) 0.018 0.61 0.82 0.48 0.42 Cellule T γδ totali al raccolto 7,93 x 1012 8,38 x 1011 6,65 x 1012 5,14 x 1012 3,78 x 1012 Espansione totale della piega delle cellule T γδ (dal giorno 0 al raccolto) 3,20 x 105 5,27 x 104 3,17 X 105 2,30 X 105 1,53 x 105 *La convalida del processo è stata ridotta a pallone con 5 celle T 106 γδ e 50 AAPC irradiati X106. I numeri riportati sono per una corsa su larga scala prevista se 24 palloni sono seminati dalla sostanza farmaceutica D7 è stata utilizzata. Tabella 3: Riepilogo della co-coltura di cellule T γδ+ con aAPC e raccolta espansa di cellule T γδ+ riportata come frequenza di cellule vive. *La convalida del processo è stata ridotta a un bioreattore a sistema chiuso (capacità di 1 L) con 5 × 106 cellule T γδ e 50 × 106 aAPAC irradiate. I numeri riportati sono per una corsa su larga scala prevista se 24 palloni sono seminati dalla sostanza farmaceutica D7. Abbreviazioni: aAPC = cellule artificiali che presentano l’antigene; TVC = conteggio totale vitale; TCR = recettore delle cellule T; CD = cluster di differenziazione; NK = cellula natural killer. Parametro di test Criteri di accettazione Risultati Convalida 1 Convalida 2 Convalida 3 Vitalità ≥ 70% 92.80% 85.50% 87.30% Mycoplasma Negativo Negativo Negativo Negativo Sterilità Nessuna crescita finale (14 giorni) Nessuna crescita finale (14 giorni) Nessuna crescita finale (14 giorni) Nessuna crescita finale (14 giorni) Macchia di grammo Nessun organismo visto (NOS) NOS NOS NOS Endotossina ≤ 2 EU/mL <0,50 EU/mL <0,50 EU/mL <0,50 EU/mL Tabella 4: Riepilogo dei risultati dei test di rilascio del controllo qualità per le cellule T γδ. Saggio residuo K562 K562 · WCB · Solo γδ Prodotto γδ + WCB Lignaggio delle cellule T e NK neg. % Residuo K562 % Lignaggio delle cellule T e NK neg. % Residuo K562 % Lignaggio delle cellule T e NK neg. % Residuo K562 % Lignaggio delle cellule T e NK neg. % Residuo K562 % 99.4 98.8 98.7 96.83 3.49 0.58 0.48 0.07 99.2 98.31 99.5 98.21 12.8 0.38 3.87 0.71 98.9 98.6 97.6 95.55 N/D N/D 14.4 0.63 99.2 98.9 97.9 96.53 N/D N/D N/D N/D 98.7 98.3 98.6 97.6 N/D N/D N/D N/D Nella media 99.08 98.58 98.46 96.94 8.15 0.48 6.25 0.47 San Dev. 0.28 0.27 0.74 1.02 6.58 0.14 7.26 0.35 Tabella 5: Cellule T e cellule NK lignaggio-negativo e residuo K562 percentuali riportate come frequenza di cellule vive. Abbreviazioni: NK = cellula natural killer; WCB = banca di celle funzionanti.

Discussion

Il Moffit Cell Therapy Lab ha sviluppato un protocollo con un’espansione bifasica di cellule T γδ altamente pure da utilizzare come DP in studi clinici. Questo protocollo fornisce un metodo di produzione secondo le linee guida cGMP in un sistema chiuso che produce un DP a cellule T γδ altamente puro che viene attivato ed espanso con successo dall’acido zoledronico e dagli aAPC WCB. Questo protocollo è stato approvato dalla FDA per la produzione di un DP allogenico a cellule T γδ per i pazienti affetti da LMA. Utilizzando donatori sani, abbiamo ampliato con successo la piccola popolazione di cellule T γδ donatrici in soli 7 giorni dal 2,06± 0,45% al 54,45± 28,34%. Dopo l’espansione di 7 giorni con acido zoledronico, è stato osservato che il donatore 2 ha avuto un aumento della popolazione NK.

L’acido zoledronico inibisce la farnesil difosfato sintasi (FDPS) nei monociti, che a sua volta porta all’accumulo di isopentenil pirofosfato (IPP), che è stato correlato con un significativo aumento della proliferazione delle cellule T e delle cellule NK ^{naturali7,8,9}. Questo aumento della popolazione NK ostacola la ^2a fase di espansione con gli aAPC, poiché gli aAPC contribuiranno solo all’ulteriore espansione delle cellule NK. Per questo motivo, i criteri dei donatori sono stati modificati per escludere i donatori con un’alta popolazione di NK. Dopo l’esaurimento delle cellule T αβ, le cellule T γδ sono state ulteriormente arricchite al 76,61 ± al 27,51%. Questo protocollo unico include una seconda espansione che utilizza gli AAPC prodotti da Moffit per colpire i recettori CD8, CD28 e CD127L nelle cellule T γδ. Questa seconda fase di espansione con le aAPC ha prodotto un DP con ≥65% per le cellule CD3⁺TCR γδ⁺, ≤1% TCRαβ T e <35% ^cd3-CD16+CD56⁺ NK. A causa dell’uso di AAPC derivati da K562, è stato necessario dimostrare che tali AAPC costituivano <1% del prodotto finale.

Il CTF Moffit ha sviluppato un test citometrico a flusso utilizzato per i criteri di rilascio per misurare la percentuale delle cellule K562 residue nel DP finale. Questo test citometrico a flusso mitiga tutti i problemi dell’utilizzo di antigeni di superficie cellulare per identificare le cellule K562. Poiché le cellule T attivate possono esprimere CD71, abbiamo ideato una strategia per escludere tutte le cellule T e le cellule NK gating su popolazioni CD3^– CD56 ^e CD16- e quindi esaminando le cellule CD71 ⁺, che sarebbero esclusivamente cellule K562. Questo protocollo dimostra che la DP delle cellule T γδ produce 0,48 ± lo 0,42% delle cellule K562 residue e soddisfa tutti i criteri di rilascio di vitalità ≥70%, negatività del micoplasma mediante PCR, nessun organismo visto dalla colorazione del grammo, ≤2 EU/ mL di endotossina e nessuna sterilità di coltura del sangue finale di crescita (14 giorni).

Materials

Hanks Balanced Salt Solution	R&D	285-GMP
Human Albumin 25%	Grifolis	65483-16-071
Plasmalyte A	Fisher	2B2543Q
Zoledronic Acid (Zometa)	Hos pira	4215-04–8	FDA approved drug
DMSO	WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH	WAK-DMSO-10
CS10	BIOLIFE SOLUTIONS	210374
3 mL syringe	BD	309657
10 mL syringe	BD	309604
20 mL syringe	BD	302830
50 mL syringe	BD	309653
100 mL syringe	JMS	992861
18g Needle	Fisher	305198
Cryovials 1.8 mL	Fisher	375418
5 mL pipette	Fisher	1367811D
50 mL pipette	Fisher	1367610Q
10 mL pipette	Fisher	1367811E
100 mL pipette	Fisher	07-200-620
15 mL conical	Fisher	05-539-12
50 mL conical	Fisher	05-539-7
250 mL conical	Fisher	430776
600 mL Transfer Pack	TERUMO BCT INC	1BBT060CB71
4" Plasma Transfer Set	INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES	03-220-90
Elutra Tubing Set	TerumoBCT	70800
100 MCS GREX	WILSON WOLF MFG CORP	81100-CS
Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system	Fisher Scientific	22-246660
Acacia Pump boot	MPS Medical In	17789HP3MLL
CliniMACS PBS/EDTA Buffer	Miltenyi Biotec Inc	130-070-525
Dornase Alpha	Genentech, Inc	50242-100-40/186-0055	FDA approved drug
1000 mL 0.22 um Filter	Fisher	157-0020
Blood Filter 170um	B.Braun	V2500
CliniMACs Tubing set	Miltenyi Biotec Inc	130-090-719
CliniMACS TCRα/β Kit	Miltenyi Biotec Inc	130-021-301
Y-Type blood set	Fenwal	FWL4C2498H
75 mL Flask	Fisher	430641U
IL-2	Prometheus	65483-116-071	FDA approved drug
AIM-V	Fisher	0870112BK
Human AB serum	Gemini Bio-Product	100H41T
3 Liter Transfer pack	Independent Medical Associates	T3109
1000  pipette tips	Fisher Scientific	5991040
CF-250	KOLBio	CF-250
Elutra	TERUMOBCT
CliniMACS	Miltenyi Biotec Inc
GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump	WILSON WOLF MFG CORP
HERAcell Vios CO2 Incubator	Thermo Scientific